Сигналдық молекулалардың сипаттамасы әр түрлі болып келеді. Түріндегі бактериялардың қасиеті өсімдіктерде тәж-галл ауруы олардың торларында ірі (95-
156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (ағылш. tumor-inducing-ісік тудыратын). Өсімдікті идентификациялау процесінде ti-плазмид – тДНК генетикалық материалының бөлігі (ағылш. transferred DNA – берілетін) жылжиды өсімдік жасушалары мен кірігуде хромосоманың қалған бөлігіне мұрагерлік материал. Тднк гендері трансформацияланған өсімдік жасушаларында экспрессияланады, олардың фитогормональды теңгерімін бұзады және спецификалық ——- қосылыстар.
Осылайша, агробактериялар табиғи «гендік инженерлер» болып табылады, ол генетикалық ақпараттың филогенетикалық қашықтығы бойынша керемет тасымалданады. Агробиттер негізінде өсімдіктердің генетикалық инженериясы үшін тиімді векторлық жүйелер құрастырылған.
Агробактириалды трансформация бактериялық және өсімдік жасушалары арасындағы өзара әрекеттесудің күрделі процесі нәтижесінде орын алады. Бұл процесте шешуші кезеңдердің бірі өсімдіктердің зақымдалған ұлпаларының экссудаттарында болатын ерекше сигналдық молекулалардың агробактерияларының рецепті болып табылады. Сигналдық молекулалар vir облысы гендерінің экспрессиясын индукциялайды
тднк кесілуін және оның өсімдіктер жасушаларына тасымалдануын бақылайтын (агробиктериалды Ti-плазмид). Агробактериалды трансформация дауыс тұқымды және екі жүзді өсімдіктердің кең ауқымында байқалады, алайда ол тек бір жынысты өсімдіктердің аз ғана санынан байқалады. Бір толқынды агробактериалды трансформацияның шектелу себептерінің бірі олардың жасушаларында процессингті индуциялайтын сигналдық молекулалардың болуы және тДНК тасымалдануы болып табылады.
Жұмыс мақсаты:
Қазіргі уақытта бір жынысты өсімдіктерде осындай сигналдық молекулалардың болуына қатысты қарама-қайшы деректер бар. Осыған байланысты, бұл жұмыстың мақсаты тДНК процессингін индуциялайтын сигналдық молекулалардың болуына рясканы талдау болды.
1. ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1. Өсімдіктердің генетикалық инженериясында ti-плазмид агробактерияларын пайдалану
1.1.1. Agrobacterium tumefaciens қысқаша сипаттамасы
Соңғы онжылдықта өсімдіктердің генетикалық инженериясы саласында айтарлықтай жетістіктерге қол жеткізілді. Генетикалық түрлендірудің әртүрлі әдістері әзірленді және қазіргі уақытта көптеген өсімдіктерде бөтен текті гендердің экспрессиясы жүзеге асырылды. Өсімдіктердің генетикалық инженериясын дамыту үшін Agrobacterium tumefaciens көмегімен ісік түзілімдерінің молекулалық негіздерін ашу аса маңызды болды.
Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae) сипатталады қатысуымен жасушаларында үлкен плазмидтер деп аталатын Ti — плазмидтер, салмағы 150 т. п. ғ. к. (Қосымшаны қараңыз) [9].
Агробактериялар көптеген екідолды және дауыс тұқымдыларда, сондай-ақ кейбір біролды өсімдіктерде ісік өсуін тудырады[2,3]. In vivo жұқтыру үшін өсімдік тіндерінің зақымдануы қажет [12].
Агробактерияның өсімдік клеткасының клеткалық қабырғасына бекітілгеннен кейін ti-плазмидтің (тДНК деп аталатын) бір бөлігін ядроға ауыстырады, онда оның хромосомадағы тұрақты интеграциясы болады.
Клеткаларды тану және оларға бекіту функциясы, сондай – ақ кесу, тасымалдау және тднк — ның өсімдік геніне интеграциясы екі хромосомды-Chva және Chvb гендерімен және ti-плазмидтегі vir-аймақтың бірқатар гендерімен кодталады [14].
Өсімдік клеткасының ядросына ауыстырғаннан кейін тДНК генмен бір немесе бірнеше көшірме түрінде біріктіре алады [15]. Ол ДНК-азе I (Schafer, 1984) жоғары сезімталдық бойынша эксперименттерде көрсетілген ДНК эукариот үшін тән қасиеттерге ие. Ti-плазмида түріне байланысты, тднк-да ісік фенотипіне жауапты жеті ден он үш генге дейін. 1 және 2 гендері ауксин синтезіне қатысатын ферменттерді, индолилуксус қышқылын кодтайды, ал 4 геннің цитокинін синтездейтін изопентенил денозин 5′- монофосфатын кодтайды.
1,2 және 4 гендерінің бір мезгілде транскрипциясы трансформацияланған жасушалардың ішіндегі фитогормондар деңгейінің жоғарылауына алып келеді. Оның нәтижесі митотикалық белсенділікті арттыру және ісіктің пайда болуы болып табылады. ТДНК басқа гендері нопапин мен октопин зерттелген опиндердің синтезін кодтайды. Опиндер-аминқышқылдары мен қанттардың туындысы, ол агробиктериялар үшін қоректену көзі болып табылады [14]. Жалпы, тәжді галлдың пайда болуы табиғаттағы өсімдіктердің генетикалық инженериясының жақсы сипатталған үлгісі болып табылады.
Агробактериялардың вирулентті гендеріндегі мутациялар. Агробий жасушаларында ti-плазмидтің болуы микроорганизмдердің патогендігі үшін қажетті шарт болып табылады. Ti-плазмидтен алынған агробийлер штамдары авирулентті.
Agrobacterium tumefaciens вируленттілігіне ісік плазмидтерінде, сондай-ақ хромосомаларда карталанған әртүрлі мутациялар әсер етеді.
Агробактериялардың өсімдіктермен, сондай-ақ хемотаксис, өсімдік клеткасының бетіне бекітілуі және инфекция орталықтарында ерекше байланысуы хромосомалық локализациясы бар гендермен бақыланады. Осы хромосомада орналасқан кейбір гендер реттейтін экспрессию vir-гендердің Ti-плазмид [19]. Агробиктердің өсімдік жасушаларына қосылуы тиімді өзара әрекеттесуді анықтайтын бірінші кезеңдердің бірі болып табылады. Бұл кезең Agrobacterium tumefaciens Chva және Chvb хромосомалық екі өлшемді бақылайды
5kb, тиісінше [Дуглас және т. б., 1985]. Бұл бұйралардың гендері айқын көрінеді. Осы облыстардың транспозондық мутагенезінің нәтижесінде агробиктерияны бекіту бойынша авирулентті немесе дефекнтты болады. Бұл бұйралардағы мутациялар бактерияның вируленттілігін төмендетеді немесе тежейді, бірақ барлық иелері үшін емес. Chvb локусы бейтарап циклдық (-d — гликанның синтезін анықтайды, ол Chva генінің көмегімен жасушаның периплазматикалық кеңістігіне айналады. Инфекциялық үдерісте бейтарап (-d-гликанның рөлі әлі анықталған жоқ. Циклдік (- d-гликаннан басқа, өсімдік жасушаларына патогенді агробактерияларды бекіту кезінде басқа полисахаридтер, атап айтқанда жасушадан тыс экзополисахаридтер қатысады.
Ti-плазмид vir-гендерін ұйымдастыру. Ti — и агробийдің вирулентті гендері
Ri-плазмидах vir саласында осы плазмидтерде ДНҚ айтарлықтай гомологиясын көрсететін 30-35 kb жуық таңбамен кластеризацияланған. Сондай-ақ, ti-плазмиді agrobacterium tumefaciens конъюгитивті плазмид tra-гендерімен vir-ген гомологиясы анықталды. —— Ti-плазмидах саласындағы vir қырына алты түрлі топтарының комплементации A, B, C, D, E және G, ұйымдасқан бірыңғай регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопинді ti-плазмида Arh 5 vir F қосымша локусы бар, ол vir e (Kooykaas et al) локусының оң жағында орналасқан., 1984]. Гендер мен ——— vir A, vir G, vir B және vir D агробиктерге трансформацияланатын өсімдіктер-иелерінің шеңбері бар хромосомдық мутациялардың көпшілігіне қарағанда авирлентті фенотип береді.
Vir-Облыстың гендер өнімдері бактериялық жасушадағы тДНК процессингін, оны өсімдік жасушасына көшіруді және өсімдіктің ядролық генімен интеграциялауды бақылайды, бұл ретте vir гендерінің бұл процестері цис-да ғана емес, сонымен қатар тДНК-ға қатысты транс жағдайда да (яғни әртүрлі репликондарда болғанда) анықтай алады. Vir аймағының осы қасиетіне сүйене отырып, өсімдіктердің генетикалық инженериясы үшін қолайлы екілік векторлар [соавт бар Дрейпер, 1991] құрастырылған және тәжірибеде табысты қолданылады. Плазмидтен тДНК-ны «кесу» процестері (дәлірек айтқанда репликативті синтез процесінде босату) және оны өсімдікке ауыстыру үшін осы аймақты ерекше шекаралармен қаптау қажет: ДНК-ның өлшемімен қайталанатын тура тізбектерімен жетілмеген 24 —- барлық зерттелген ti-және Ri-плазмидте Елеулі гомология танытады. Тднк шекаралары oriT конъюгативті плазмид аймағында гомологиялық.
Бұл салада-спецификалық эндонуклеазалар плазмида көлігі процесінде болатын тарқатылатын орамның түрі бойынша репликация басталуымен қызмет ететін бір нүктелі үзілісті шығарады. Репликация плазмиды аналық жасушада сақтауды және оның көшірмесінің еншілес жасушада пайда болуын қамтамасыз етеді.
ТДНК қалыпты процессингі және оны өсімдік клеткасына тасымалдау үшін, әсіресе, тднк тасымалдау полярлығын анықтай алатын оның оң шекарасы маңызды. Ti-плазмидтің оң шекарасын алып тастау агробактериялар толығымен авирулентті етеді. Оны жасанды синтезделген, солға ауыстыру микроорганизмдердің вируленттілігін қалпына келтіреді.
Бактериялар клеткаларындағы тДНК процессингіне vir D, vir C және vir E – оперондарының гендеріндегі мутациялар, т-кешенінің көлігіне vir B және vir D – оперондарының гендеріндегі өсімдік клеткасына мутациялар әсер етеді.
1.1.2. Ti-плазмид негізінде векторларды құру
Сексенінші жылдардың басында ДНҚ-ның бөтен реттілігін өсімдік жасушаларына немесе транспозон мутагенезінің көмегімен ауыстыруға алғашқы талпыныстар жасалды [Uernals-teens et al., 1980], немесе тднк — ға гендердің арнайы қоныс аударуы арқылы және кейіннен екі есе рекомбинациямен
Ti-жабайы типті плазмид [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981].
Алайда, екі есе рекомбинацияға негізделген бұл ерте эксперименттер көп уақыт алды, өте күрделі болды және трансформациялар өте төмен жиілікпен өтті. Бактериялармен генетикалық манипуляцияларды жеңілдету және трансформаттардың селекциясы мен регенерациясын мүмкіндік беру үшін неғұрлым тиімді векторларды әзірлеу қажет болды.
Қазір ti-плазмид көмегімен өсімдіктерге бөтен гендерді енгізу үшін түрлі екі жүйені пайдаланады:
—- екілік векторлар.
Құру негізінде——— векторлардың гендері тДНК емес ——- өсімдік жасушалары үшін, және ТДНК шекараларының арасында орнатылған ДНҚ-ның кез келген салдарлығы, хромосома өсімдік жасушасының интеграциялануы мүмкін және қалыпты онда [Zambryski et al., 1983]. В ——— тднк векторлық жүйелерін, мысалы, pbr322 тізбегіне ауыстыруға болады, ал өсімдікке ауыстыру болжанатын бөтен ДНҚ осы векторда қайта бағыттау керек.
1.1.3. Бактериялық жасушадағы тДНК процессингі және оны өсімдіктер жасушаларына тасымалдау
Процессацияланған тДНК нысандары. Agrobacterium tumefaciens өсімдіктің механикалық бүлінген бөліктері бар, протопластпен Регенерациялайтын немесе болған кезде——— бактериялар жасушаларынан тднк процессирленген әртүрлі молекулалық формаларды бөлуге болады – Бір тізбекті сызықты, екі тізбекті сызықты және екі тізбекті сақиналы, олар генетикалық материалды өсімдік жасушасына тасымалдауда делдал рөліне үміткер болуы мүмкін [——-, 1980]. Бір гибридті шекараның пайда болуымен тДНК-ның оң және сол жақ шекарасының арасында гомологиялық рекомбинация есебінен түзілетін сақина нысаны өте аз мөлшерде кездеседі. Ол пайда болған кезде ДНҚ репликативті синтезі болмайды, ал басқа екі нысан пайда болған жағдайда, өсімдікке транспотр процесінде бактериялардағы тДНК репликациясы өтуі мүмкін (бір тізбекті формалардың пайда болуына үзілуі, кешіктіретін тізбектің үзік синтезін тежеуі мүмкін). Репликация тднк-ны бастапқы Ti — плазмидте сақтауды қамтамасыз етуге арналған, егер тек шекараларда екі нүктелі үзілулердің пайда болуы есебінен Ti-плазмидтен тДНК материалының физикалық кесілуі мүмкін болмаса.
Ti-плазмидтен тДНК-ның жоғалуы екінші жоспарға ұқсас «эксцезиялық модельдің»бас кемшілігі болып табылады. Дегенмен, шекаралар ішінде екі нүктелі ажыраулардың пайда болуы және бактериялық жасушаларды өсіру кезінде тднк сызықтық екі нүктелі түрінің детектацияланатын мөлшерінің пайда болуы ———- зерттеушілер осы индукторды сәрсенбі күні қосқаннан кейін 30 минуттан кейін байқады. Сондай-ақ vir-гендер индукциясы жағдайында —
—— жасушаларында агробактерий анықталады сызықтық одноцепочечная нысаны процессированной тДНК [Stachel et al., 1986].
Бұл интермедиаттың пайда болуы индуктор қосылғаннан кейін сегіз сағаттан соң анықталады және оның саны келесі 40 сағат бойы екі еседен артық жиналады, содан кейін процесс шектелгенін көрсете отырып, кемуге барады.
Бактериялық мембрана арқылы бактериялық жасушаға қандай түрленуі осы уақытқа дейін әр түрдің салыстырмалы мөлшерін анықтау және олардың өзгеру динамикасын анықтау қиындықтарынан анықталмады. Мүмкін, тднк процессингі мен көлігі уақыт бойынша ажыратылмаған және конъюгациялық жасушалардың мембраналарының түйіскен жерінде болатын плазмид конъюгациялық тасымалдануы сияқты ұштасқан болуы мүмкін [Clark and Warren, 1979]. Сонда барлық табылған интермедиаттар бөлінбейтін процестің қандай да бір кезеңінде үзілген (немесе дұрыс аяқталған) аберрантты нысандар болуы мүмкін. Vir-гендердің индукцияланған экспрессиясы жағдайында——- өзара әрекеттесудің басты элементі жоқ-бактериялық жасушаның және өсімдік жасушасының байланысы, сондықтан осы жағдайда табылған барлық нысандар делдал рөліне белгілі бір жорамалдармен ғана үміткер бола алады.
Өсімдік клеткасына тек бір тднк тізбегі түсіп, екі нүктелі өсімдік клеткасына айырбасталатыны белгілі.
Agrobacterium tumefaciens торында өткен жағдайда талқыланады —
—— тДНК жартылай консервативті репликация кезінде екінші тізбек тасымалданатын тізбекті көлік үшін энергияны босата отырып, гидролизденуі мүмкін.
1.1.4. Agrobacterium tumefaciens көмегімен өсімдіктерді трансформациялау жүйесін әзірлеу
Өсімдіктердің генетикалық трансформациясы бойынша бастапқы эксперименттердің көбі ti-плазмидтарымен агробиктериялардың көмегімен поранен алынған өсімдік жасушаларын жұқтыру арқылы қабылданған. Стерильдікті сақтау үшін жиі бүкіл өсімдіктердің орнына in vitro эксплантаттары жұқтырды. Бактериялар содан кейін алып, ортаға цефотоксин немесе карбенициллин қосты. Трансформанттар қалыпты емес ортада іріктелді.
Одан әрі қарусызданбаған векторлар мен жаңа селективтік маркерлер құрылғаннан кейін трансформанттардың көп санын беретін неғұрлым тиімді әдіс әзірленді: өсімдік протопластарымен немесе жапырақтардың эксплантанттарымен агробийлерді кокультивациялау. Агробактериялары бар немесе бактериялы протопласттарды кокультивациялау ——
— , ісік пайда әкеледі [Marton et al., 1979, Wullems et al.,
1981]. Содан кейін мұндай тәсіл агробиктермен өсімдік жасушаларын трансформациялау үшін сәтті қолданылды., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].
Бұл әдіс одан әрі фидерлік дақылдар деп аталатын пайдалану жақсарды [Fraley et al., 1983]. Дегенмен, барлық аталған әдістер протопластардан (мысалы, темекі және петуния) оңай қалпына келтіруге болатын өсімдіктерді трансформациялау үшін жарамды. Бұл мәселені протопласттардың орнына парақты дискілер бар агробактерияны жеңу оңай., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986].
Стерильді табақ дискілері ——— антибиотикаға төзімділіктің қандай да бір селективті маркерін қаруланбаған Вектор құрамында алып жүретін агробиотикалық заттар. Содан кейін жапырақтардың тілімдері қашудың пайда болуы үшін ортасы бар фидер тостағандарда екі күн өсіреді. Осыдан кейін оларды бактерияларды жою үшін цефотоксинмен және қандай да бір антибиотикпен ортаға апарады
(мысалы,———) трансформанттарды іріктеу үшін. Қалпына келтірілген қашу тамырлар береді, содан кейін өсімдіктер одан әрі эксперимент жүргізу үшін топыраққа көшіріледі.
Табақ дискілерін трансформациялау әдісі жеңіл және жылдам трансформацияның жоғары жиілігінің тамаша үйлесімі болғандықтан——- трансформанттардың регенерациясы, бұл тәсіл әлемнің көптеген зертханаларында қолданыла бастады. Сонымен қатар әдістің кейбір модификациялары ұсынылды.
Arabiodopsis дискілерін трансформациялау жиілігін арттыру үшін агробактерияларды өңдеу ұсынылды——— [Sheikholeskam a. Week S,
1987], ол болып табылады гендерінің индукторы еместігін көрсетті vir [Stachel et al., 1985]. Алайда, парақты дискілерді трансформациялау әдісі поранения орнында дифференциалды емес жасушалардан қашуды қалпына келтіруі мүмкін өсімдіктердің түрлерін ғана трансформациялау үшін қолданылады.
Табақ дискілерін трансформациялау әдісімен қатар, сабақты сегменттері бар конъюгирленген агробактериялар кеңінен қолданылады[An et al. Бұл ескертуді дәлдеп ауыстыру қажет Draper, 1987], микрокаллус
[Pollock et al, 1985] және өсіп келе жатқан тұқымдармен [Feldmam a. — Алматы: «Мектеп» баспасы, 2007.
Агробидтердің тұқымдарын трансформациялау әдісі алғаш рет арабидопсис үшін қолданылған және ерекше назар аударуға тұрарлық, себебі матаның мәдениетімен жұмыс істеуді қажет етпейді.
1.1.5. Өсімдікке көшірілген бөтен гендерді сақтау мәселесі
Әртүрлі әдістердің көмегімен өсімдік жасушаларына көшірілген бөтен ДНҚ, әдетте ядролық генге кіреді және Менделдің заңдарына сәйкес мұраға қалдырылады[De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Ингерация аймақтары, шамасы, кездейсоқ түрде геном бойынша бөлінген.
Белгілі бір сайттарға гендерді кірістіру бұрын жануарлар жасушалары жүйесінде сипатталған [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] және жақында мұндай тәсіл өсімдіктерді трансформациялау үшін табысты қолданылды [Paszkowski et al.,
1988].
Көптеген жағдайларда бөтен текті ДНҚ реттілігі бір бұйра немесе бір көшірмеде, не тандемді ендірмелер кластері түрінде тұрады, бұл in situ [Mouras et al гибридизациясы арқылы көрсетілген., 1986]. Алайда, әр түрлі хромосомаларда екі немесе одан да көп бөліктерде көп қондырмалар жиі байқалады [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a.
Marus, 1987]. Осыған байланысты көптеген жағдайларда физикалық тізбексіз гендердің контррансформациясы алынды, кейбіреулердің сегрегациясы F1 ұрпағында өтті [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986].
Чужеродыне гендер әдетте беріледі ұрпағы дәрежесі жоғары тұрақтылық кезінде мейозе [Muller et al., 1987]. Алайда, кейде мейоздан кейін өзгермелі фенотип жоғалуын байқады[Potrykus et al., 1989].
Ашуланып, бұл бөтен геннің белсендірілуіне байланысты болды (мысалы, ДНҚ метилдеу кезінде). Интеграция чужеродной ДНҚ барлық внеядерные геномы, мысалы, хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], сондай – ақ негізгі желі бойынша-денделевтік емес мұра түрі бойынша жүреді.
Көптеген зерттеушілер трансформанттар мен олардың ұрпақтарын талдау үшін Саузерн [Southern, 1975] бойынша гибридизациялау әдісін пайдалана отырып, іріткі салынған, тандемді немесе бөтен гендердің қайта салынған көшірмелерін, әсіресе ДНҚ протопластқа тікелей тасымалдағаннан кейін жиі кірістіру байқалатынын көрсетті [Krens et al., 1985]. Тандемдердің пайда болуы, жиі 5-тен 20 көшірмелерге дейін, генмен интеграциялану алдында рекомбинацияның жанында түсіндіруге болады[Szernilofsky et al., 1986;
Wirtz et al., 1987]. Инвертирленген қайталаулардың пайда болуы тДНК бар векторларды қолдану кезінде бөтен ДНК қайта құрудың негізгі түрі болып табылады —
— Ti-плазмидтер [Jorgensen et al., 1987].
Сонымен, өсімдіктерді трансформациялау бойынша тәжірибелерді жүргізу кезінде бөтен ДНҚ иесінің геніне кірер алдында әртүрлі модификацияға ұшырауы мүмкін екенін ескеру қажет. Дегенмен, интеграциядан кейін, әдетте мейоз кезінде оның әртүрлі қайта құрылуы мүмкін
[Czernilofsky et al., 1986]. Мұндай жағдайларда ең қалаған генотипі мен фенотипі бар мұқият іріктелген трансформанттардың тоғыспалы тозаңдануы алдын ала болжанатын призанактары бар ұрпақ береді.
1.1.6. Трансформацияланған өсімдіктердегі бөтен гендердің экспрессиясын талдау
Өсімдіктердегі бөтен гендердің экспрессиясын сапалық және сандық талдау үшін РНК Нозери-талдауын қоса алғанда, көптеген әдістерді қолданады[Nagy et al., 1988] және Вестери-өнімдерін талдау трансдукции [Burnette, 1981]. Сонымен қатар, антибиотиктер мен гербицидтерге төзімділік сияқты фенотиптік белгілерді зерттейді. Cat, npt II, октопин — и гендері сияқты репортер гендерінің экспрессиясын талдау үшін——— сезімтал әдістер әзірленді
[Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].