Жүрек ырғағының биологиялық жүргізушісін құру

Өлім-жітім бойынша жүрек-қан тамырлары аурулары бұрынғысынша әлемде жетекші орын алады. Ең көп таралған жүрек патологияларының бірі — миокардтың әртүрлі функционалдық және органикалық зақымданулары (ең алдымен инфаркт, ишемиялық ауру, туа біткен немесе жүре пайда болған жүрек ақаулары және т.б.) болуы мүмкін аритмиялар. Қалыпты жұмыс істейтін Жүректе миокардтың ритмикалық қысқартулары Сино-атриальды түйіннің жасушаларында кенеттен пайда болатын импульстер әсерімен жүреді (сурет.1). Әйтпесе ол ритмнің алғашқы жүргізушісі немесе пейсмекер (ағылш. pacemaker-ырғақты береді). Одан қозу предсердия бойынша таралады, оларды синхронды түрде қысқартады және қан қарыншаға айдайды және атрио-вентрикулярлы түйінге жетеді. Одан әрі ГИС шоғыры арқылы электрлік импульс оның соңғы тарамдалуына — Пуркинье талшығына жетеді және қарыншалардың қысқаруын тудырады, соның салдарынан қан жүректен ағза мүшелері мен тіндеріне айдалады.

Сур.1. Жүрек ырғағы жүргізушісінің және өткізгіш жүйенің орналасу сұлбасы.

Егер қандай да бір себеппен сино-атриальды түйіннің қозуы туындамаса немесе жүрекшеге ауыса алмаса, оның рөлін жүрекшеде немесе атрио-вентрикулярлы қосылыста оқшауланған екінші ретті пейсмекерлер орындайды. Толық көлденең блокада жүрекшеден қарыншаға қозу толық бұзылған кезде қарыншалардың өткізуші жүйесінде орналасқан пейсмекерлер қосылады. Егер бұл болмаса, онда қарыншалардың тоқтауы мидың қайтымсыз зақымдануына және тіпті өлімге әкелуі мүмкін.

Жүрек автоматизмі толық бұзылғанда миокардтың қоздырғыштығы біраз уақыт бойы сақталады, сонда жасанды ритм — кардиостимулятор жүргізушілері көмекке келеді. Жарты ғасырға жуық пайдалану үшін (батареяны қоректендіретін жүрек ырғағының бірінші портативті жүргізушісі 1957 жылы әзірленген) электрондық пейсмекерлер өздерін өте жақсы көрсетті, дегенмен олардың бірқатар кемшіліктері бар. Біріншіден, олар жүрек бұлшық етінің физикалық және эмоциялық жүктемелерге реакциясын реттемейді. Екіншіден, мысалы, бала ауырған жағдайда, кардиостимулятордың салмағы мен оның электродтарының көлемі маңызды болады, олар көбінесе пациенттің өсуі мен дамуына сәйкес келмейді. Үшіншіден, пейсмекер электродының жүрегінде орналасуынан қозу мен қысқартуды оңтайлы белсендіруге қол жеткізу мүмкін емес. Төртіншіден, ритмнің жасанды жүргізушілері мезгіл-мезгіл тестілеуі тиіс және әрбір 5-10 жыл сайын батареяны ауыстыруды қажет етеді, яғни іс жүзінде қайталанатын операция. Ақырында, кейбір аспаптар (соның ішінде медициналық аспаптар — мысалы, томографтар) электрондық пейсмекердің жұмысына әсер етуі мүмкін.

Әрине, ең заманауи кардиостимуляторлар да жақсы болса да, балама іздеу қажет. Перспективті шешімдердің бірі-биологиялық ырғақтың жүргізушісі, ол шексіз уақыт жұмыс істей алады, физиологиялық топтарға жауап бере алады, жағдайларға байланысты жүрек ырғағын өзгертеді және кез келген адамның ауру ерекшелігін ескере отырып, жүректі белсендіреді. Соңғы онжылдықта гендік және жасушалық терапияның белсенді дамуы осындай биологиялық пейсмекер құрылып, кардиологияда аритмияны емдеудің жаңа тәсілі пайда болады деп үміттенуге мүмкіндік береді [1].

Биологиялық пейсмекерлерді құру бойынша барлық зерттеулерде екі тәсіл қолданылды: плазмид немесе вирустық векторлар құрамында арнайы гендерді енгізу және дің жасушаларының әртүрлі түрлерін пайдалану. Жұмыстарды жоспарлау кезінде сино-атриальды түйіннің келесі сипаттамалары назарға алынды:

— слагающие оның жасушалары ст, т. е. үшін тағайындалған бастамашылық жасау жүрек жиырылуының [2];

— импульстердің спонтанды генерациясы ағзаның физиологиялық және эмоциялық қажеттіліктеріне сәйкес келеді, бұл иондық арналар мен сорғылардың өзара әрекеттесуімен байланысты.];

— импульстердің таралуы қысқартуды белсендіру үшін оңтайлы болуы керек.

Зерттеу стратегиясын әзірлеу кезінде сино-атриальды түйінде спонтанды импульстердің қалыптасуы арналары жүзден астам миллисекунд ашылған If арнайы тогының іске қосылуы нәтижесінде орын алады, ал осы токтың өзгеруі уақыт өте жақсы жүрек ырғағын түзейді [4, 5]. Пейсмекер тогына кіріс (мысалы, INa) және шығыс (IK) токтары, сондай-ақ кіріс тогының ұлғаюы және/немесе шығыс тогының азаюы жүрек ырғағының жиілеуіне алып келетін олардың өзара әрекеттесуі қосылады [3, 6-10].

Гендік терапия

Оның медиаторларының (адреналин мен норадреналин) әсерінен пайда болған симпатикалық жүйке жүйесінің жүрек автоматизміне әсері жақсы зерттелген. Осыған байланысты биологиялық пейсмекерлерді құру жөніндегі алғашқы жұмыстар B-адренорецепторларды белсендіруге бағытталған болатын, бұл мембраналық ақуыздардың фосфорлануына және кіріс токтарының күшеюіне әкеледі. Зерттеушілер 2-адренорецептор-ді кодтайтын генмен арнайы құрастырылған плазмидті векторды шошқа жүрегіне енгізу нәтижесінде жүрек автоматизмінің жоғарылауына қол жеткізуге үміттенді [11, 12]. Шынында да, жүрек ырғағы бастапқы деңгейден жоғары болды. Табысқа жету жолы салынды, алайда нәтиже 24 сағатқа созылды және осы бағытта зерттеуді жалғастыра отырып, ритм жүргізушісінің тұрақты жұмысына қол жеткізуге болатынына сенім болмады. Бұл жағдайда бар пейсмекерлік белсенділікті түзету немесе жаңасын қалыптастыру екені анық емес еді.

Келесі қадам ik гиперполяризациялық токқа әсер ететін эксперименттер болды [13, 14]. Осы мақсаттар үшін пайдаланған аденовирусный вектор со встроенным мутантным геном тажибаев исламбек 2.1, кодирующим бір белок субъединиц калиевого арна [13]. Бұл гендік құрылым теңіз шошқасының сол жақ қарыншасының қуысына енгізілді, бұл 3-4 күннен кейін ik калий тогының 80% — ға басылуына әкелді. Осы уақыт ішінде спонтанды ритм электрокардиограммада тіркелді және кардиомиоциттердің әсер ету әлеуеті оның жоғары деңгейін анықтады. Мұндай тәсілдің басты кемшілігі-IK тогын басу аритмияның себебі болуы мүмкін. Сонымен қатар, кіріс токтардың қайсысы осы жағдайда жүректің пейсмекер қызметін қамтамасыз ететіні анық емес, сондықтан мұндай жұмыстардың салдары болжанбайды [15].

Біздің зертханада жүргізілген эксперименттер стратегиясы қалыпты жағдайда тек қана сино-атриальды торап жасушаларында генерацияланатын if (немесе автоматика тогы) пейсмекер тогының қарқындылығын арттыруға бағытталған. Бұл аралас ток (натрий иондарымен де, калий иондарымен де қалыптасады) табиғатта бірегей, өйткені бұл әрекет потенциалының ұзақтығын ұлғайтпайтын және автономды жүйке жүйесімен реттелетін жалғыз ток [16, 17]. Сондай — ақ, If өткізетін арналар HCN (Hyperpolarization activated, Сyclic Nucleotide gated — гиперполяризация белсендіріледі, ал қақпалардың жағдайы — ашу және жабу-циклдық нуклеотидтерге байланысты) тұқымдас ақуыздардан тұрады. Ген НСN2 аденовирусты векторға кіргізіп, жасушалық мәдениетке енгізді, бұл тек If жоғарылауына ғана емес, сонымен қатар сынған жасушалар санының айтарлықтай артуына әкелді [18]. Сонымен қатар, оларға изопротеренол (катехоламиндердің синтетикалық аналогы) әсер еткенде бұл жасушалар оң хронотропиялық әсерге (жүрек ырғағының үдеуі) және ацетилхолинге теріс хронотропиялық әсерге, әдетте, дені сау ағзада болатындай жауап берді. Демек, бұл жасушалар физиологиялық топтарға жауап бере алады [19].

Эксперименттер катетердің көмегімен сол жүрекше аденовирусты құрылымға — AdHCN2 және AdGFP (GFP — green fluorescent protein — жасыл флуоресцирлейтін ақуыз, оның гені түрлі-түсті «белгі»синтезі үшін пайдаланылатын) енгізген иттерде жалғастырды. Содан кейін стимуляцией блуждающего нервісінің (наркоз) қол жеткіздік езгінің синусового ырғақ. Төрт күннен кейін аденовирус инъекция аймағында жаңа ритм пайда болды, ол тек AdGFP немесе физиологиялық ерітіндіні енгізген бақылаудағы жануарларда болған жоқ [20]. Сонымен қатар, инъекция орнынан алынған жүрек бұлшықетінің дезагрегирленген жасушаларында нативті кардиомиоциттермен салыстырғанда 100 есе үлкен тығыздықта пейсмекер тогы анықталды.

Сол иттердің қарыншалық өткізгіш жүйесіне AdHCN2 қайта енгізілуі синустық ырғақтың тежелуі кезінде төрт-жеті күннен кейін инъекция орнында тұрақты сырғитын ырғақтың пайда болуына әкелді — бақылаумен салыстырғанда минутына 60-қа жуық соққы (күріш.2) [21]. HCN2 жоғары экспрессиясы иммунохимиялық және биофизикалық әдістердің көмегімен дәлелденген.

Сур.2. Gfp генімен және gfp және HCN2 гендерімен аденовирустық конструкцияларды енгізген иттердің ЭКГ.

Инъекцияға дейін екі иттің синус ырғағы шамамен бірдей болды. Оның тежелуінен кейін, ол кезбе нервтің стимуляциясынан (стимуляция уақыты бағыттамалармен белгіленген) пайда болды, идиовентрикулярлы ритм пайда болды, және де екі генді енгізген жануарда ол жиілеп, бақылаумен салыстырғанда тез пайда болды. Жазбалардың үлкейген фрагменттерінде бірінші жағдайда (AdGFP + AdHCN2) қозу сол қарыншада, ал екіншісінде (AdGFP) — оң жақта пайда болады.

Әрине, гендік терапияның барлық аталған тәсілдерінен соңғысының нәтижелері ғана үміт артады, өйткені тек бұл жағдайда ғана қолайлы физиологиялық деңгейдегі сырғитын идиовентрикулярлы (өздігінен қарыншалық) ырғағы тұрақты пайда болды және автономды нервтер мен олардың медиаторларын белсендіруге туындаған ырғақтың жауаптарының дәлелдері алынды. Және де таңдалған стратегия кейбір күмән тудырады, себебі синустық ырғақты тоқтатқаннан кейін және идиовентрикулярлы пайда болғанға дейін 5-тен 30 с-қа дейін өтеді, бұл клиникалық тұрғыдан рұқсат етілмейді. Аденовирустық құрылымды инъекция арқылы ұзақ белсенділікке қол жеткізе алатыны немесе ол тек күндер немесе апта ғана сақталады. Күмән геннің қысқа мерзімді экспрессиясынан туындаған, ол аденовирус қасиеттеріне байланысты. Себебі, нысананың ядросында аденовирустың геномы негізінен эписомальды түрде, яғни, әрбір бөлу циклінде жасушаның ДНК-полимеразасы арқылы репликацияға ұшырайтын шеңберден тыс молекулалар түрінде болады. Вирусты ДНҚ жұқтырылған жасушаның геномына желілік түрде енгізілуі мүмкін, дегенмен, вирустық ДНҚ эписомалдық көшірмелерінің саны интегралдағыдан әлдеқайда көп болады, бұл иммундық жүйені белсендіреді және түрлендірілген жасушаның бастапқы күйге оралуына әкеледі. Сонымен қатар, аденовирус — кәдімгі суықтың себебі, сондықтан кейбір адамдар аденовирустық капсидке (ақуызды жабатын) антиденелердің жоғары деңгейі болуы мүмкін, бұл adhcn2 жасушаға түсуін қиындатады. Басқа вирусты векторлар, мысалы, РНК-ретровирустар бар, бірақ кейбір артықшылықтарға ие (берілу тиімділігі, геномдық интеграция, тұрақты экспрессия) әлеуетті патогендер, өйткені ол онкогенді тізбектерге ие.

Жасушалық терапия

Эмбрионалды дің жасушаларының кем дегенде 350 әр түрлі жасушада түрленуі қабілетін ашу оларды белсенді зерттеуге түрткі болды және оларды биология мен медицинада, соның ішінде кардиологияда пайдалану перспективаларын ашты. Алайда, саралаудан кейін қажетті желінің жасушалары болуы мүмкін ізашарлар-жасушаларын анықтау және бөліп алуды үйрену керек еді. 1999 жылы жарияланған «Science» — да Д. Томсон мен Дж.Адам эмбрионалды дің жасушаларын бөліп алып, мамандандырылған жасушалардың алғашқы желілерін алған Беккер өткен жүзжылдықтың биологиясындағы маңызды үшінші оқиға болып танылды (ДНҚ Қос спиральының ашылуынан кейін және адам геномының шифрленуінен кейін).

Эмбрионалды дің жасушаларының белгілі бір кіші типтері ырғақтың шынайы жүргізушілерінің спонтанды импульстеріне ұқсас импульстерді тудыратыны анықталғанда, бұл жасушаларды биологиялық пейсмекерлер ретінде пайдалануға тырысты[22]. Бірақ мұнда да көптеген проблемалар пайда болды.

Біріншіден, жетілмеген эмбрионалды дің жасушалары дифференциалауды тоқтатқаннан кейін пейсмекердік сипаттамаларды жоғалтуы мүмкін болғандықтан, егер алынған кардиомиоциттердің дамуын сино-атриальды жасушалар сатысында тоқтату мүмкін болса, үлкен жетістік болар еді.

Екіншіден, қайта отырғызылған жасушалардың спонтанды ырғағын қандай арналарды анықтау маңызды, және бұл адамның жүрегінде ырғақты шынайы жүргізушілердің жұмысын қамтамасыз ететін арналар екенін көз жеткізу. Бұдан басқа, жасалған конструкция вегетативтік нервтердің стимуляциясына қалай жауап беретінін білу керек, яғни жаңа кардиомиоциттердің автономды нерв әсеріне сезімталдығын анықтау керек. Бұл сұрақтар ритмнің құрылған жүргізушілерінің әлеуетті аритмогендігіне байланысты пайда болды [23]. Бұл сұрақтарға жауап бере отырып, мыналарды түсінуге болады: бұл жағдайда аритмияның дамуы — артефакт (мысалы, эксперименттік манипуляциялардың салдары) немесе эмбрионалды дің жасушалары негізінде құрылған биологиялық пейсмектердің әлеуетті қауіпті қасиеті. Ақыр соңында, жасушалардың саралануын аяқтағандарға ағзаның иммундық жауабы мәселесі шешілмеген. Біздің ойымызша, эмбриональды, полипотентті (яғни. бұл ретте, «иммуноференизациядан» пайда болады-дамудың соңғы сатыларында Елеулі иммундық жауапты тудырмайды [24].

Бастапқыда дің жасушалары ересек ағзаның сүйек миында (дәлірек айтқанда, мезенхимада немесе стромада, сүйек кемігі) табылды. Кейіннен олар ересек жануарлар мен адамның барлық органдарында бар екені анықталды; дегенмен, әдетте олар сүйек миынан бөлінеді. Осылайша, перспективаны алдамшы пайда болды: әртүрлі патологияларды жасушалық терапия үшін мезенхималық дің жасушаларының банкін құру. Қандай да бір себептермен донорлық дің жасушаларын пайдалануға болмайтын жағдайда, олардың көзі пациенттің өз сүйек миы бола алады. Алайда, практикаға енгізілгенге дейін, биоқауіпсіздікті, атап айтқанда, «иммундық-жеңілдігін», дің жасушаларын мұқият зерттеу қажет.

Біз негізгі эксперименттік материал ретінде ересек адамның мезенхималық дің жасушаларын қарастырдық. Ең алдымен бізді жасушалық желілердің тұрақтылығы мен олардың төмен антигенділігі тартты. Алайда, адамның мезенхималық дің жасушалары if пейсмекер тогын генерациялау мүмкін емес, сондықтан оларды hcn2 генімен жүктеу қажет болды, ол if қалыптастыратын және тасымалдаушы ақуыздар синтезінің трансляциясына жауап береді. Бұл электрорация әдісі арқылы жасалды: жасушалар пульсирлеуші электр өрісіне орналастырылды, соның арқасында жасушалық мембранада тесіктер уақытша ашылды, ол арқылы hcn2 гені бар вирусты тасымалдаушы еніп, жұқтыру тиімділігі 35-45% құрады [25].

Сур.3. GFP және HCN2 гендері бар адамның мезенхималық дің жасушаларын имплантациялаудан кейін бес күн өткен соң, оның сол жақ қарыншасының эпикардасында ЭКГ. Солдан оңға қарай: адасқан нервтің стимуляциясын бастағанға дейін және одан кейін синус ырғағы, қынап стимуляциясы кезінде идиовентрикулярлы ритм және адасқан нервтің стимуляциясын тоқтатқаннан кейін синус ырғағын қалпына келтіру.

Түрлендірілген адам діңгек жасушалар экспрессированным геном HCN2 болды пересажены шағын область эпикарда сол жақ қарыншаның иттер [25]. Бір аптадан кейін оларда сино-атриальды торап ырғағының тежелуі аясында минутына 60 қозу жиілігімен сырғанау ырғағы дамыды (сурет.3). Діңдік жасушаларды имплантациялау орнында ритм көзін оқшаулау флуоресцентті оптикалық карталау әдісі арқылы анықталды *.

* «Трансмембранды әлеуеттің оптикалық өлшеулерін американдық зерттеуші Л. Коэн ойлады. Идея жасушалық мембранамен байланысқан арнайы синтезделген молекулалар-флуорофорлардың қасиеттеріне негізделген, бұл молекула орналасқан электр өрісінің шамасына байланысты тиімділікпен жарықты жұтып, сәуле шығаруға қабілетті. Осылайша, флуороформен боялған жүректі жарықтандыра отырып, флуоресценция толқынының қарқындылығы мен ұзындығының өзгеруі бойынша трансмембраналық әлеуеттің кинетикасын оптикалық өлшеуге болады. Сонымен қатар, жарықты екі өлшемді тіркеудің заманауи әдістерін пайдалана отырып, Жүрек бетіндегі трансмембраналық әлеуетті өзгерту картасын жасауға болады. Өлшеудің оптикалық табиғаты оптикалық үлкейтуді оңай ауыстыру арқылы сигналдарды карталау кеңістіктік ажыратуын өзгертуге мүмкіндік береді. Қазіргі уақытта трансмембранды әлеуетті картаға түсіру кеңістіктік масштабтың кең ауқымында: бірлі-жарым жасушадан тұтас жүрекке дейін жүзеге асырылады». (И. Р. Ефимов, А. Т. Самбелашвили, В. Н. Никольский / / Аритмия жаршысы. 2002. № 26. С. 91-96.) — Примеч.ред.

Гистологиялық зерттеулер миокардқа отырғызылған ит мезенхималық дің жасушалары бір — бірімен және қарыншалық миоциттермен тесік байланыстар деп аталатын-қан ақуыздары, ұштасқан жасушалар арасында электр тогын алып жүретін (күріш.4) [26]. Алынған пейсмекерный ток проявлял типтік оған қасиеті: жанданды кезде гиперполяризации жасушалары толғандырып, катехоламиндер және ацетилхолин және блокировался цезием [25].