1. Олигонуклеотидтердің жасанды синтезі
Рибо — немесе дезоксирибонуклеозидтердің (РНК және ДНК типті) берілген жүйелілігінің жасанды химиялық синтезі.
Бірінші нуклеотид ретпен оның 5′-фосфатты тобы арқылы химиялық түрде қатты төсекте, мысалы, полистиролмен бекітіледі. Барлық әлеуетті химиялық белсенді топтар мен оның нуклеин негізінің атомдары (аминотоптар, оттегі) инертті «қорғау»қосылуымен уақытша оқшауланады. 3′-ол қант тобы бұғатталмайды.
Рибозаның немесе дезоксирибозаның 3-ші тобына жататын барлық нуклеотидтер да алдын ала нуклеинді негіздер бойынша ғана емес, сондай-ақ қорғалады. Қанттың 5′-жағдайына қосылған фосфор қышқылының белсенділігі оның оттегінің бірі бойынша хлорбензолдың «навеспен» қайтыс болады. Осылайша, реакция үшін бұл қышқылдың тобы ғана бос қалады.
Енді реакциялық ортаға берілген тәртіп бойынша екінші ретпен нуклеотид енгізеді-қорғалған, ол сипатталғандай. Екі ОН-топтың арасындағы реакцияда су ыдырайды және екі нуклеотидтердің ковалентті фосфодиэфирлі байланысы орнатылады. Содан кейін 3′-тен химиялық қорғаныс алынып тасталады-ол қосылған екінші нуклеотид және реакциялық ортаға үшінші қорғалған нуклеотид енгізеді… Және олай бұдан әрі. Әрине, судың ыдырауы және фосфодиэфирлі байланыстың түзілуі өздігінен емес, күрделі химиялық катализатордың қатысуымен жүреді.
Олигонуклеотидтің берілген тізбегінің синтезі аяқталғаннан кейін барлық қорғаныс алынады және олигонуклеотид қатты төсеніштен бөлінеді.
Қазіргі заманғы Автоматты синтезаторлар олигонуклеотидтердің «құрастыруын» жүздеген нуклеинді негіздерге дейін ұзындығына берілген бағдарлама бойынша өндіреді.
Жақында олигонуклеотидтердің жасанды тізбегін химиялық катализаторды осы тізбекті синтездің әрбір келесі сатысында лазер сәулесімен сәулелеуге ауыстыра отырып өсіру әдісі табылды. Бұл көп ұзамай бізге пайдалы.
ДНҚ қажетті фрагментінің бір жібінің кесіндісін сипатталған тәсілмен ала отырып, матрица бойынша екінші жіптің құрылысын ДНК-полимеразаға тапсыруға болады.
1.1 ақуыз Секвенаторлары
Зерттеушінің қарамағына бастапқы ақуыздағы аминқышқылдарының одан әрі кезектілігі үшін қажетті тағы бір автомат туралы бірнеше сөз айту қалады. Мұндай автоматтың бірінші нұсқасы 1967 жылы Эрдман мен Бегг ұсынған. Ол өзін жақсы көрсетті, ол әлі күнге дейін сақталған. Жалғыз ғана, бірақ оның маңызды емес жақсаруы қазіргі заманғы секвенаторлар ақуыз молекуласының екі ұштарынан аминқышқыл тізбегін талдай алады (N-соңы және С-шеті), Эрдман ұсынған реакциялар тізбегі осы екі міндеттердің біріншісін ғана шешкенде.
Аталған химиялық реакциялар тізбегі егжей-тегжейлі бізге әлі қол жетімді емес, сондықтан мен реагенттердің физикалық жай-күйі мен сипаттамаларына назар аудара отырып, оның 3-ші кезеңінің жалпы ауызша сипаттамасымен шектеймін.
1-ші кезеңде Сулы, аздап сілтілі ортада күрделі органикалық зат зерттелетін ақуызға оның N-соңынан қосылады. 2-ші кезеңде ол белоктан бөлініп, өзімен бірге соңғы амин қышқылын алып кетеді. Бұл кезеңді қышқыл сусыз ортада өткізу керек. Нәтижесінде соңғы амин қышқылының күрделі және өте гидрофобты туындысы және бір буынға қысқартылған ақуыз алынады. Оларды аздаған ақуыз тұнбаға түсетін органикалық еріткішке ауыстыра отырып, өзара бөлуге болады, ал модификацияланған аминқышқыл осы еріткіште оны одан әрі (хроматографиялық) сәйкестендіру үшін аспаптан шығарылуы мүмкін. .Келесі циклды бастамас бұрын ақуыз Сулы, сәл сілтілі ортада қайта ерітілуі тиіс.
Реакцияның толық циклі барысында еріткіштерді өзгерту, компоненттердің бірін (ақуыздарды) тұндыру, екіншісін экстрагирлеу, тұнбаларды жуу, оны кептіру және қайтадан еріту қажет екені анық. Белгілі бір бағдарлама бойынша барлық осы операцияларды реакциялық ыдыспен қызмет ететін жылдам айналатын (>1500 айн/мин) шыны кесе арқылы жүзеге асыруға болады (сурет. 32).
Сур. 32.
Оған ақуыз ерітіндісінің бастапқы препараты енгізіледі. Орталық түтікше бойынша тостағыштың конустық түбіне бірінен соң бірі қажетті сұйық реагенттер беріледі. Айналудың арқасында олар жұқа қабатпен кесе қабырғаларына көтеріледі. Олардың саны мен айналу жылдамдығын қабат ішкі бетінің жоғарғы бөлігінде орындалған жыраларға жетпейтіндей таңдауға болады. Сұйықтықтың қабырғасына жақын жұқа пленка затты одан басқа жұқа пленкаға экстракциялау үшін өте қолайлы. Ол алдыңғы сұйықтықпен араласпайтын органикалық еріткішті құрайды, ол бірінші қабықтың бетіне көтеріледі. Мұнда Центрифугалау жүзеге асырылады. Шыныаяқтардың қабырғаларында ақуыздың қысқартылған полипептидті тізбектері шөгеді, ал органикалық еріткіш реакциялық қоспадан ыдыраған гидрофобтық туынды кезекті амин қышқылдарын жуады. Осы мақсат үшін еріткіш артық беріледі, оның қабаты жыраға дейін көтеріледі, одан екінші түтікше арқылы модификацияланған аминқышқылының ерітіндісі фракция коллекторына түседі. Қабырғаларға тұндырылған ақуыз сол жерде жуылады және кептіріледі, содан кейін сәл сілтілі су ортасында қайтадан ерітіледі. Содан кейін барлық цикл қайталанады…
Кейінгі жылдары Эрдман мен Бегг аспабы техникалық жетілдіріліп, компьютерлік бақылауға ауыстырылды, бірақ оның құрылғысының бастапқы принципі сақталды.
2. Жеке ақуыз мөлшерін көбейту
Ген бактериясына плазмидпен екінші сезілген қызмет өнімі ретінде жеке ақуыздың көп мөлшерін өңдеу перспективасы. Бұл ген бастапқыда бізге қажетті ақуыздың синтезін кодтаған ген болуы керек. Тек және барлығы! Бірақ қарап көрейік, бұл генді тек біздің иелігімізде ақуыздың бар-жоғына қарай ала ма? Бұл міндетті жануар тектес ақуыз үшін шешеміз. Мұнда ол иРНК сплайсингіне байланысты қиын және іс жүзінде маңызды. Оның шешімінде екі кезең анық көрінеді:
1) бізді қызықтыратын ақуыз синтезіне жауапты жеке иРНК алу.
2) осы иРНК базасында ДНҚ-ның екі жақты құрылымын жасау, егер барлық ген болмаса, онда оның «маңызды» бөлігі-иРНК тиісті экзондарының синтезін талап ететін тізбекті учаскелердің жиынтығы. Мұндай» рационалды қысқартылған » генді плазмидке қосуға болады. Ол бактерия-реципиентте толыққанды иРНК синтезін қамтамасыз етеді, ал содан кейін бізге қажетті ақуыздың өңделуін қамтамасыз етеді. Осы екінші кезеңнен бастау ыңғайлы болады.
2.1 белгілі иРНК бойынша геннің «таңбалы» бөлігін ойнату
Біз өзіміздің жеке иРНК жеткілікті саны бар деп болжаймыз. Осы иРНК метаморфозын тікелей пробиркада геннің тиісті бөлігіне шығаруға мүмкіндік беретін операциялардың кезектілігін қарастырайық.
Бізге жануар текті иРНК өзінің 3′-соңында аденин нуклеотидтерінің ұзын «құйрығы» (поли А) екені белгілі.
1 кезең. Біздің иРНК ерітіндісіне ондық-басқа дезоксириботи-мидиндердің (олиго дТ) ұзындығы жеткілікті көлемде олигонуклеотид қосамыз. Біз оны қалай синтездеуге болатынын білеміз. Бұл үшін оңтайлы жағдайлар жасайды (буфер, тұз концентрациясы, орташа жоғары температура). Біз 2-ші кезең басталатын құрылымды аламыз.
2 кезең. Ерітіндіге әлі кездеспеген фермент — «кері транскриптазаны»қосамыз. 4 дезоксирибонуклеотидтердің қатысуымен бұл фермент матрицаның соңында қалыпты бағытта РНК матрицасы бойынша ДНҚ комплементарлы синтезін жүргізуге қабілетті. Ол да праймерді қажет етеді, ол үшін 3′-ның соңында иРНК олиго дТ
3 кезең. Алынған РНК-ДНК бұрын аталған гибридті Рибонуклеазамен өңдейміз. Ол ДНҚ-мен екі сатылы гибридті кешендегі РНҚ-ны бұзады (сол жерден қараңыз). Алайда, бұл ферментті біздің иРНК — тің соңына дейін бұзылмайтындай жағдайға жеткіземіз-оның шағын учаскелері қалды.
4 кезең. Ол ДНҚ матрицалық синтезін ғана емес, s’-S* экзо-нуклеаз белсенділігіне ие. Осының арқасында ол иРНК қалдықтарын бұзады және сол ДНК-лигагасының көмегінсіз, ДНК-ның толыққанды жігін синтездеген фрагменттерден құралады.
Осылайша алынған екі желілі молекула «кДНК» деп аталады, ол бастапқы иРНК комплементарлы бейнелеуі болып табылады. Бұл ДНҚ біздің геннің маңызды бірізділігіне сәйкес келеді, өйткені барлық интрондар (бұл тағы бір рет қайталаймын) бастапқы иРНК ядросынан цитоплазмаға шығу кезінде «кесілген» болды. РНК-полимераза плазмидтік ДНК транскриблирлеуге тура келетін бактериялар осы кіріктірілген кДНК учаскесінде бізді қызықтыратын ақуызды синтездеу үшін толыққанды иРНК шығарады.
2.2 ЧИП-әдістеме
Генді алу тапсырмасының қарапайым бөлігі, біздің иелігімізде қажетті жеке иРНК бар. Бірақ оны қалай алуға болады, егер біз бізді қызықтыратын ақуыз синтезделген жануар тектес жасушалардың кейбір санын ғана иеленеміз, және, демек, оған сәйкес иРНК бар?
Әлбетте, осы жасушалардың барлық иРНК-ның жиынтық фракциясын барлық басқа РНК-дан бөліп алу керек. Ол үшін жеткілікті мөлшерде молекуланы қозғалмайтын қатты негізде бекіту жеткілікті сол олиго дТ және олардың жанынан барлық бөлінген РНК жасушаларының ерітіндісін жіберу жеткілікті. Бұл колондық» аффинды » хроматография әдісімен жасалады,біз өз уақытында егжей-тегжейлі танысамыз. Сонымен қатар, жылжымайтын олиго дТ-ның бекітілген жиынтық РНК-ның жанынан өтетін ерітіндісінен иРНК-ның барлық молекулаларын олардың а «құйрығымен» гибридизациялау жолымен алып тастайтын жағдайлар жасау қиын емес екені анық. Барлық басқа РНК тыныш өтеді. Содан кейін кез келген жұмсақ тәсілмен (қыздыру немесе әлсіз сілтінің әсері) А — олиго дТ гибрид поли сутекті байланыстарын бұзуға және ерітіндіде барлық иРНК жиынтық фракциясын алуға болады.
Енді осы жиынтық фракциядан бізді қызықтыратын ақуыздың синтезіне жауапты бізге қажетті жеке иРНК алу үшін іс. Мұны істеу қиын емес сияқты көрінеді.
Біз ақуыз секвенаторы арқылы аминқышқыл тізбегін (кем дегенде толық емес) орната аламыз. Бұдан әрі генетикалық кодты пайдалана отырып, біздің ақуыздағы амин қышқылдарының (жетіден кем емес) белгілі бір бірізділігіне жауап беретін нуклеотидтердің (20-дан кем емес) кейбір дәйектілігін белгілеу қажет. Жоғарыда сипатталғандай, осы тізбекті синтездеу, қайтадан қозғалмайтын негізде бекіту және оның жанынан барлық иРНК жиынтық ерітіндісін жіберу. Өз генінің (жасанды синтезделген болсын) жеткілікті ұзын учаскесі бар гибридизацияның арқасында біз енді біздің жеке иРНК-ны аулай аламыз. Қателер мүмкін емес. Екі түрлі иРНК-да бірдей ретпен болу ықтималдығы, 20 нуклеотидтердің ұзындығы бір геннің бөлігіне комплементарлық нөлге тең.
Бәрі қарапайым, бірақ… генетикалық код-бұл туған. Бізге неоткуда қалай бұл нақты жағдайда қолданылды бұл вырожденность. Және бұл кенеттен тапсырманы өте қиындатады. Жоғарғы жол біздің ақуыздың белгілі амин қышқылдық жүйелерінен таңдап алынған жеті амин қышқылдарының тізбегін білдіреді. Ең ауыр жағдай емес. Жеті амин қышқылдарының екеуі ғана 4 кодоннан жауап береді. Бірде-бір» алтыодонды » аминқышқылдары жоқ, тіпті бір ғана кодоны бар триптофан көрінеді. Тіпті бұл жағдайда да бізге қажетті иРНК-ны «ұстау» үшін барлық нұсқаларды сынауға тура келеді. Яғни, 21 нуклеотидтің бір тізбегін емес, рұқсат етілген кодтарды пайдаланудың барлық рұқсат етілген комбинацияларын толық қамтитын барлық мүмкін болатын тізбектерді синтездеу. Олардың санын есептеу қиын емес: 4-2’2’2-4’1-2 = 256.
Сонымен, 256 21 мүше олигонуклеотидтерді синтездеу және 256 рет барлық иРНК жиынтық фракциясымен Гибридизация бойынша тәжірибелерді қайталау қажет болады. Бұл-үлкен жұмыс (Гибридизация бойынша мыңдаған параллель тәжірибе қою керек болатын басқа да қазіргі заманғы зерттеулермен салыстырғанда бос болса да).
Олигонуклеотидтердің синтезі туралы ойлауға әзірше болмайды. Дегенмен, оларды машина жасайтын болады. Бірақ 256 рет Гибридизация бойынша тәжірибе қайталаңыз! Барлық қажетті шаюмен және бақылаумен. Мұнда автоматтандыру қажет. Сонымен қатар, тиісті құрал ғылыми аппаратура нарығында пайда болуы тиіс. Және ол пайда болады.
Қарапайым теледидардан артық емес үстел аспабын елестетіңіз. Жаппай, қатаң көлденең орнатылған болат плитада «плашкаларды» дәл бекіту үшін ұя бар. Соңғысы өлшемі 95 х 130 мм плексигластан жасалған тікбұрышты пластинканы білдіреді. Ай бағандары мен қатарлары нөмірленген. Оларға алдын ала мономерлердің су ерітіндісінің қоспасын 10 микролитрден құйып, содан кейін кеуекті полиакриламидті гель, осы айналымның жарық сезгіш катализаторы және бізге қажетті синтетикалық олигонуклеотидтерге айналады. Бұл мысалда 256 түрлі олигонуклеотидтерді 256 айға енгізу керек — компьютер арқылы көрсетілген бағдарламаға сәйкес, ол аспаптың одан әрі барлық манипуляцияларын басқаратын болады.
Басқа жерде сол массивті плитада серіппелі тіреулердің көмегімен белгілі бір жағдайларға микроскоптан сегіз заттық шыныға дейін қойылуы мүмкін. Бұл шынылардың жоғарғы беті ультракүлгін жарықтың әсерінен полиакриламидті гельмен байланысуға қабілетті белсенді химиялық заттарды алып жүретін гидрофобты пленкамен жабылған. Сонымен қатар, осы пластинада диаметрі 2 см екі ірі құдық бар. Екінші құдыққа этанол құйылады. Ақырында, осы плитада плитаның астындағы кептіру камерасына кіретін тесік жасалған.
Екінші массивті плитаның төменгі бетінде бірінші метрнен жоғары орналасқан барлық жылжымалы жүйе құрастырылған. Ол екі прецизионды жүріс бұрамаларынан тұрады, олардың айналуымен оларға бекітілген «каретка» төменгі плитаның үстінде кез келген орынға жеткізілуі мүмкін. Бұрандалардың айналуы, әрине, компьютерді басқарады.
Кареткада диаметрі 0,3 мм тік Болат ине, төменгі жақ тегіс. Оған диаметрі 1 мм болат сақина тіректе орнатылған.
Берілген бағдарлама бойынша механикалық жетек 1 секунд ішінде инені және шығыршықты кезекті плашка шұңқырынан дәл қалыпқа келтіреді. Иненің шеті осы тасымалдау кезінде сақинадан жоғары көтеріледі. Содан кейін сақина бірден шұңқырға түседі. Сақинаның шағын диаметрінің арқасында сұйықтық оның жазықтығында тұрақты пленка құрайды. Содан кейін, сондай — ақ, 1 секунд ішінде каретка инені сақинамен пәндік шынылардың бірінен берілген жағдайға — ±10 микрон дәлдігімен ауыстырады! Иненің құрғақ өзегі түсіріледі, пленка өтеді, суланады және жеңіл соққымен (серіппе!) шыныға қатысты. Оның сұйықтығы шайқалады. Шынының бетінде диаметрі 0,3 мм кішкентай тамшы пайда болады, ол шыныда жабынның гидрофобылығы арқасында ағып кетпейді.
Содан кейін ине мен сақина Тез су құйылған құдықтың үстіне ауыстырылады және оған түсіріледі. Бір уақытта сорғы, сақина және инелер белсенді түрде шайылады. Содан кейін олар дәл сол сияқты этанолы бар құдыққа, содан кейін кептіру камерасына ауыстырылады… Ине операциясының сипатталған сериясы басталғаннан кейін шамамен 5 секундтан кейін және сақина тағы да басқа шұңқырға (бағдарламаға сәйкес) және барлығы қайтадан қайталанады. Біздің барлық 256 сынамаларды толтыру үшін 25 минуттан артық емес. Шыныдағы тамшылар арасындағы интервалдар 0,2 мм тең. Осылайша, 8 мм жағы бар квадрат алаңында біздің барлық олигонуклеотидті «зондтар» орналасады. (Егер олар екі мың болса, онда барлық сегіз зат шынысын алуға тура келеді, ал құрал 3 сағаттан артық жұмсайды.)
Шыныдағы орынды мұндай үнемдеу (8х8 мм) барлық 256 тамшы бинокулярлы лупа (түсіру сапасын көзбен бақылау үшін) көру алаңына, содан кейін компьютерге және оның мониторына байланысты таратушы теледидар камерасының экранына орналастыру үшін қажет.
Сипатталған аспап (GMS-417 Arrayer маркалары) нарықта салыстырмалы түрде жақында пайда болды (1998 жылы) және әзірге «ЧИП-приборға»қарағанда жақсы атау алған жоқ. Ағылшын тілінде Chip жоңқасын, жұқа бөлігін білдіреді. Осыдан жастар өте бағалы картоп «Чипсы» және «чиптер» микроэлектроникасында — мыңдаған транзисторлар орналасқан кішкентай пластинкалар. Жалпы, электрондық өнеркәсіп технологиясының әртүрлі табыстары заманауи ғылыми-зерттеу аппаратурасын жетілдіруге үлкен әсер етті.
Бұл туралы сипатталған сол бағыттағы жаңа құрылғы принципі айқын дәлелдейді. Онда олигонуклеотидті зондтардың синтезі лазерлік сәуленің басқаруымен шыныда тікелей жүргізіледі. (Мұндай мүмкіндік олигонуклеотидтердің химиялық синтезі идеясын баяндау кезінде айтылды.) Бұл әдісті пайдалана отырып, 1 шаршы сантиметрге миллион зондтарды орналастыруға болады!
Бірақ біздің тәжірибемізге ораламыз. Тамшыларды заттық шыныда одан әрі өңдеу ЧИП-аспаптан тыс жүргізіледі. Шыны ультракүлгін жарықпен сәулеленуге арналған камераға тасымалданады. Оның әсерімен полимерленеді және шыныға полиак-риламидті гель» тігіледі». Онда олиго-нуклеотидтер бар. Алайда, гельдің үлкен кеуектілігінің арқасында олардың едәуір бөлігі Гибридизация үшін қолжетімді болып қала береді. Гель кептіріледі.
Барлық иРНК молекулаларына алдын ала химиялық, шынжырдың соңына флюоресцентті белгі бекітіледі. Содан кейін шыны иРНК осылайша барлық қылыштардың қоспасы бар ерітіндінің жұқа қабатымен жабады. Будандастыру үшін қолайлы жағдайларда ұстайды. Содан кейін сумен шаяды барлық иРНК, связавшихся с зондами. Тек қана қажетті иРНК молекулалары бізді қызықтыратын ақуызды кодтаған геном учаскелерінің біріне дәл сәйкес келетін олигонуклеотидтердің бұрынғы тамшыларының бірінде «қанықпайды». Флюоресценция бойынша лазерлік сәуленің әсерінен ирнк молекулалары бар тамырға сәйкес келетін теледидар камерасының линзасын бекітеді. Компьютер олардың координаттарын көрсетеді және монитордың экранындағы жарық нүктесін көрсетеді.
Содан кейін осындай жолмен табылған иРНК гибридтен босатуға және жоғарыда сипатталғандай кДНК алу үшін пайдалануға болады. Осылайша, осы тараудың басында бірінші тапсырма шешілді. Егер осындай жолмен алынған кДНК плазмидке кіруден басталатын барлық келесі экспериментті қамтамасыз ету үшін жеткіліксіз болса, апат болмайды. Бұл санды алынған үлгі бойынша бірнеше рет көбейтудің салыстырмалы қарапайым жолы бар.
Әдебиет
1 Душкин М. П., Иванова М. В. төменгі тығыздықтағы липопротеидтер, холестерин және оның тотығу өнімдерін ішке енгізгенде перитониялық макрофагтардың пенисталық жасушаларға трансформациясы. // Патофизиология және эксперимент. терапия. -1993. -N 2. -С. 9-11.
2 Дятловская Э. В., Безуглов В. В. липидтер биоэффекторлар ретінде. Биохимия. 1998. Т. 67. вып. 1.- С.-3-6.
3 Ершова Л. П., Курбанова Г. Н., Толығырақ Оқу А. Жарақаттан кейінгі анемия механизмдері туралы. // Пат.физиология. 1992. -N 2.-С.-54-55.