Иондық алмасу хроматографиясы туралы қазақша

Жылжымалы және қозғалмайтын фазалар

Шынайы хроматография нұсқаларын қарауға көшкенде, «жылжымалы «және «қозғалмайтын» фазалар ұғымдарын енгізу пайдалы. Фракцияланатын молекулалардың колонкамен төмен қозғалуын білдіреді. Жылжымалы фазаны, әрине, түйіршіктерден тыс молекулалар құрайды. Олар элюент тогымен бірге қозғалады. Қозғалмайтын фаза-түйіршіктер ішіндегі молекулалар. Мұндай бөліну гельді сүзу кезінде де орын алды. Онда көрсетілген мағынада қозғалмайтын молекулалар түйіршіктерді толтырған қозғалмайтын су ортасында ерігуіне байланысты осындай болды. Әрине, бұл ортада олар броундық қозғалысты жасады, бірақ бұл оларды колонкадан шығуға итермеді. Түйіршіктердің өз материалымен олар өзара әрекеттессе, онда таза механикалық — түйіршіктер түзетін полимердің жіптеріне итеру.

Ион алмасу хроматографиясы жағдайында, керісінше, қозғалмайтын фаза негізінен түйіршіктер материалымен байланысты молекулаларды құрайды (онда»сорбированные»). Бұл жағдайда соңғылардың кеуектілігі фракцияланатын молекулалардың барлық ішкі көлемін толтыра отырып, түйіршіктерге іс жүзінде бөгетсіз еніп бара алатындай етіп таңдайды.

Ион алмасу хроматографиясының атауы молекулалардың түйіршіктермен байланысы иондық болуы тиіс екенін көрсетеді. Яғни, гранулалар жіптерінде бекітілген және молекулалардың бетінде бар қарама-қарсы белгілердің иондары арасында кулондық тартылыс күштерімен анықталады. «Бекітілген» және «бар» деген сөздер бір рет және мәңгі тіркелген жағдай туралы ойға жетелейді. Сонымен қатар, ион алмасу хроматографиясы әдісінің икемділігі мен тиімділігі осы жағдайды басқару мүмкіндігіне, сонымен бірге фракцияланатын заттың молекулаларының гранул матрицасы — осы молекулалардың сорбция сипатымен байланыс күшіне сүйенеді.

Ионогенді топтар

Матрица жіптеріндегі өзгермейтін иондардың орнына және макромолекулалардың (мысалы ақуыздардың) бетінде «ионогенді топтар» орналасады, олар қоршаған су ортасындағы жағдайларға байланысты (рН, тұздардың болуы) өздерін ашық, ионды электр заряды ретінде көрсете алады, немесе оларға қарама-қарсы иондардың, мысалы Na+ немесе С1 -, ал кейде диссоциация немесе н+протондарының қосылуы есебінен бейтараптандырылады.

Белоктардың бетінде ионогенді топтармен лизин және аргинин немесе аспарагин және глутамин қышқылы сияқты амин қышқылдарының бүйір тармақтары аяқталады. Протонның диссоциациясы бірінші жағдайда және екінші қауымдастық осы топтарды бейтараптандырады. Бұл екі процесс қоршаған су ортасындағы протондардың концентрациясына, яғни рН шамасына (тиісінше сілтілі немесе қышқыл аймақта) байланысты. Химиялық модификацияның орнына, екі аталған құбылыстар сияқты, ионогенді топтың зарядын бейтараптандыру қоршаған ортадағы ионогенді топқа жақын кулондық күштің әсерінен қарама-қарсы зарядталған ионмен экрандалуының есебінен де болуы мүмкін. Ковалентті химиялық байланыс түзілмейді. Бұл жағдайда экрандаушы ион «контрион»деп аталады.

Өзінің оң зарядын көрсетуге қабілетті ионогенді топтар «аниониттер»деп аталады-олар электр тізбегіндегі анодқа ұқсас. Өзінің теріс зарядын ашатын топтар тиісінше «катиониттер»деп аталады. Хроматографиялық түйіршіктер жіптерін модификациялау үшін тәжірибе әртүрлі «күштің»иоаногенді топтарының аздаған санын іріктеп алды. «Анионобменниктер» үшін ең көп қолданылатын (аниониттер көтеретін хроматографиялық матрицалар): диэтил-ноэтил — ДЕАЕ және ди-этил-2-оксипропиламиноэтил-QAE қысқартылған белгісі. Осы топтардың біріншісі Протонды жоғалту есебінен сілтілі ортада химиялық жолмен бейтараптандырылуы мүмкін. Екіншісі-ортаның рН мәні кезінде оң заряд алады және теріс зарядталған контрионмен ғана экранизациялануы мүмкін. Осы ерекшелікке сәйкес деай негізіндегі анион алмастырғыштар «әлсіз» деп аталады, ал qae негізіндегі алмасушылар «күшті»деп аталады.

Сол сияқты ионогенді топтар теріс болған жағдайда «катион алмастырғыштар» әлсіз «болады — олар карбоксиметильді топтар және сульфопропильді топтар модификацияланған» күшті «болады. Осы топтардың қысқартылған белгілері, тиісінше, СМ және SP. Күшті катион алмастырғыштар барлық жұмыс биологиялық диапазонында өзінің теріс зарядын сақтайды (рНЗ—11) және тек оң контриондармен экрандалуы мүмкін.

Бұл полисахаридтер негізіндегі бізге таныс түйіршіктер: сефадекстер, химиялық тігілген агароздар мен целлюлозалар. Олардың сауда атауларында матрица материалының атауы және ионогендік топтың қысқартылған нұсқауы да бар. Мысалы:» ДЕАЕ-сефадекс»,» QAE-целлюлоза»,» СМ-сефадекс»,» SP-сефароза CL » және т.б. әр түрле түйіршіктер мен ЖҰЖ өлшемдерімен ерекшеленетін бірнеше алмасу ұсынылады.

Ион алмасу хроматографиясына арналған матрицалар жоғары қысымда (силикагель негізінде) мен жағында қалдырамын. Pharmacia фирмасы ақуыздардың жылдам хроматографиясының өз жүйесі үшін тек қана өлшемі бойынша біртекті түйіршіктердің екі түрі күшті ион алмастырғыштардың негізінде әзірленген: «Моно Ф» сауда атауымен анион алмастырғыш — триметиламинометил және «Моно S» катион алмастырғыш-сульфометил белсенді тобы .

Енді кейбір кеңістіктік қатынастарды елестету пайдалы болады. Ақуыздарды тазалауға және фракциялауға бағдарланатын боламыз,өйткені бұл ион алмасу хроматографиясын пайдаланудың негізгі саласы. Глобулярлық ақуыздардың диаметрі (олардың массасына қарағанда) өте көп емес. Мысалы, бұқа сарысулық альбуминнің молекуласы (м = 69 000) көлденең 70 А, ал гамма-глобулиннің молекуласы (М =150 000) шамамен 100 а бар.)

Мұндай айларда ақуыздар молекулалары 30-40 см ұяшықтың қабырғасы бар сымнан жасалған кеңістіктік торда теннис доптары сияқты еркін қозғала алады.

Белоктардың бетінде екі белгінің аминқышқылдарының ионогенді топтары (барлығы әлсіз) болуы мүмкін, бір-бірінен бірнеше ондық ангстремдер қашықтықта тұруы мүмкін. Түйіршіктер ішіндегі ионогенді топтар тығыз орналасуы мүмкін, өйткені он-топтар бойынша қосылу әрбір глюкоза буынында жүзеге асырылуы мүмкін. Бірақ бұл пайдасыз, себебі өте жақын орналасқан екі топтармен бір мезгілде екі ақуыз молекуласының өзара әрекеттесуі мүмкін емес және тиімсіз, себебі бірнеше нүктелерде бір молекуланың тым берік байланысымен байланысты. Тәжірибе ионогенді топтар арасындағы орташа қашықтықты бір матрицада 10-30 А құрайды.

Иондар және контриондар

Ион алмастырғыштың тесігін толтыратын сұйықтықта контриондар бар екенін тағы да еске салу керек. Біріншіден, экспериментатордың билігіне әрдайым бейтарап түрде, яғни контриондармен (Na+, K+ немесе С1 — Нысандар) бірге түсетін ион алмастырғыштың өзінен. Екіншіден, бұл ионогенді ақуыз топтарының контриондары және, ақырында, бұл элюентте зерттеуші еркі бар иондар.

Контриондар, электростатистикалық тартылу арқасында тиісті иондарға жақын, бірақ химиялық байланыспен байланысты емес. Сондықтан, су молекулаларының жылу соққысының әсерінен жеңіл контриондар ионогенді топтардан едәуір қашықтыққа жиі кетеді, ал кейде олардан мүлдем үзіледі (кулондық күштер қашықтықпен өте тез жойылады). Бірақ көп ұзамай бұл контриондар қайтарылады немесе сол сияқты басқалармен ауыстырылады. Контрион ионогенді топтың ионына жақын болғанда, ол зарядының өрісін бейтараптандырады (экрандайды), алыстатылған кезде — ионның электр өрісі үшін басқа иондармен, оның ішінде ақуыз молекуласына жақын қалған бетінде ашылған иондармен өзара іс-қимыл жасау мүмкіндігі ашылады.

Егер матрицада зарядтың жалаңаштауы шаммен ілесе, ал өзіміз «супергномдарға» айналып, ион алмастырғыштың түйіршіктерінің ішінде болып, біздің көзімізге сансыз көптеген көлемді шашыратқандардың жарқырауының сиқырлы бейнесі көрінер еді. (Мысалы, қызыл, егер зарядтар оң болса.) Элюенттегі тұздың концентрациясы неғұрлым жоғары болса, соғұрлым ион алмастырғыш зарядтарының әрқайсысы ашық болып қалады және тиісінше олардың аз саны бір уақытта ашылар еді — қызыл жарықтың жарықтары қысқа және оттар саны азайған болар еді. Егер ион алмастырғыш әлсіз болса, онда осы «фейерверкаға» қатысатын матрицаның ионогенді топтарының жалпы саны элюенттің рН өзгерістерін, ионогенді топтардың химиялық бөлігін бейтараптандыра отырып реттеуге болады.

Енді біздің қиялдағы суретті ақуыздың ірі молекулаларымен баяу жүзіп тұрыңыз. Олар да өрт сөндіреді. Бірақ екі түсті: қызыл және көк, өйткені ақуыз бетінде оң аниониттерден басқа теріс ионогенді топтар бар-катиондар. Әрине, олар үшін контриондар да бар. Орта рН өзгергенде белоктың әлсіз ионогенді топтарының жарылу қарқындылығы артады және бір мезгілде басқа (басқа түсті) жарылу қарқындылығы азаяды. Элюенттегі тұз иондары өз зарядына сәйкес рН ионогенді ақуыз топтарының есебінен оқшауланбаған электр белсенділігіне әсер етеді.

Ақуыздарды хроматографиялық фракциялау

Белоктардың қоспасын колонкаға енгізгеннен кейін алғашқы минуттарда олардың әрқайсысы үшін элюенттің рН мәні мен тұз концентрациясының берілген мәніне жауап беретін тіркелген және еркін молекулалардың динамикалық тепе-теңдігі орнатылатындығын елестету оңай. Сонымен бірге осы молекулалардың жылжымалы және қозғалмайтын фазаларда шоғырлануының динамикалық тепе-теңдігі. (Гельді сүзуге қарағанда, айырғышта сорбция арқасында Концентрациялардың тепе-теңдігі қозғалмайтын фазаға қарай қатты жылжиды.)

Элюция басталғаннан кейін еркін ағымдағы элюент түйіршіктерден шыққан молекулаларды колонкамен төмен қарай алып кетеді. Нәтижесінде жоғары тұрған қабаттағы Концентрациялардың динамикалық тепе-теңдігі молекулалардың қозғалмайтын фазадан жылжымалы фазаға шығуы есебінен қалпына келтірілетін болады (неғұрлым төмен жалпы деңгейде). Ал төменгі бастапқы «бос» қабатта түйіршік екі фазадағы Концентрациялардың динамикалық тепе-теңдігі молекулалардың элюенттен түйіршіктерге өтуі және олардың сорбциясы арқылы пайда болады. Колонкаға түсетін бос элюенттің жаңа порцияларымен бұл процесс одан да көп молекулаларды төменде орналасқан қабаттан көп молекулаға көшіре отырып, жалғастырылатын болады… Осылайша, байланысты белок аймағы бірте-бірте (және өте баяу) колонкамен төмен жылжиды. Бұл жылжыту олардың жеке ерекшеліктеріне сәйкес әртүрлі ақуыздарда әртүрлі жылдамдықпен жүреді. Бірінші кезекте ақуыз бетінде ионогенді топтардың саны мен кеңістіктік орналасуы. Осылайша, колонкадан қозғалатын аймақтар қоңырау тәрізді формадағы тар «шыңдар» түрінде шыққанға дейін жалғастырылатын болады. Бұл шыңдар дәл сол тәртіппен және сол аралықтармен (немесе жабындармен) шығады!) тиісті белоктардың байланыстыру аймағының бағанасы бойынша қандай қозғалғаны. Бұл шын хроматографиялық фракциялау процесі.

Осы уақытқа дейін біз белоктың бетінде екі және одан да көп ионогенді топтардың болу мүмкіндігін елемедік. Алайда, бұрын келтірілген сандардан белок глобуласының бетіндегі осындай екі топ арасындағы және ион алмастырғыштағы ионогендік топтар арасындағы қашықтықтардың шаманың бірдей тәртібі болады. Бұл оқиғалардың келесі тізбегін іске асыру мүмкіндігін білдіреді.

Ақуыз молекуласы өз зарядтарының бірінің қозғалмайтын ионмен электростатикалық байланысы нәтижесінде бір нүктеде бекітіледі және осы нүктеге қатысты бұрыла бастайды. Осындай бұрылыстардың бірінде оның бетіндегі екінші заряд айырғыштың өтетін жіптеріне қарама-қарсы белгі зарядының жанында болуы мүмкін. Ақуыз молекуласының матрицамен екінші электростатикалық байланысы пайда болады. Мұндай оқиға жағдайды сапалы өзгертеді. Белоктың алмасғышта бекітілуі екі есе емес, шаманың тәртібіне неғұрлым берік болып табылады. Бұл екі байланыстың тәуелсіздігімен байланысты, бұл оларға бір-бірін «сақтандыруға» мүмкіндік береді. Су молекулаларының жылу соққысымен байланыстардың бірі бұзылған. Екінші байланысы бар ақуыз молекуласы бастапқы байланыс орнынан алыс кете алмайды. Ол осы екінші байланысқа бұрылады және мұндай бұрылыстар барысында алғашқы байланыс қалпына келтіріледі. Екінші сәтте осы екі байланыс рөлдермен өзгеруі мүмкін.

Бұл «өзара сақтандыру» құбылысына қосылу үшін, яғни екінші байланыс үзілген сәтке дейін бірінші үзілген байланыстың қалпына келтірілуін тоқтату үшін элюенттегі тұз контриондарының концентрациясын айтарлықтай ұлғайту қажет. Егер ақуыз молекуласы үш нүктеде бекітілсе, оны шешу өте қиын немесе тіпті мүмкін емес (ион алмастырғышта ақуыздың қайтымсыз сорбциясы болады).

Айтылғанға байланысты ақуыз қоспасын фракциялау үшін препаратты колонкаға енгізгенге дейін матрицамен қоспаның барлық ақуыздары үшін екі нүктелік байланыстан артық емес түзілуіне кепілдік беретін тұз ерітіндісімен алмастырғыштың сұйық фазасын теңестіру керек.

Хроматография шарттарын таңдау (мысалы, ақуыз қоспасын фракциялау үшін)

Бұл таңдау, тіпті бөлуге жататын ақуыздардың барлығы белгілі және, сонымен қатар таза түрде болған жағдайда да, фракциялау және тіпті белгілі бір интуиция негізінде жатқан Физикалық процестерді түсінуді қажет ететін күрделі іс болып табылады. Өте қауіпті (бағалы препаратты жоғалту тұрғысынан) дәл осындай немесе өте ұқсас жағдай үшін ғылыми әдебиетте сипатталған хроматография шарттарын қайталауға тырысу. Сол маркалы ион алмастырғыштың (олар партиядан партияға дейін түрленеді) немесе пайдаланылатын Реактивтердің нақты сипаттамалары басқаша болуы мүмкін. Бастапқы препараттардың ерекшеліктері сияқты. Сипатталған рәсімді назарға ала отырып, зерттеуші өзінің хроматографиялық экспериментін ойластыруы және жоспарлауы тиіс. Мұнда кем дегенде кіреді:

1. Ион алмастырғышты таңдау (оның күші, түйіршіктер мөлшері, кеуектілігі).

2. Колонканың геометриясын таңдау (ұзындығы және диаметрі).

3. Буфердің рН фракциялаудың неғұрлым тиімді шарттары тұрғысынан таңдау, сондай-ақ қоспаның барлық ақуыздарының, мысалы ферменттердің биологиялық белсенділігін сақтау.

4. Элюенттегі тұздың (контриондардың) концентрациясын таңдау.

5. Элюция түрін таңдау: изократикалық( тұздың өзгермейтін концентрациясы бар), сатылы немесе градиентті (және градиенттің қандай түрі!)

6. Элюция жылдамдығын таңдау.

Осы жағдайлардың барлығын фракциялау нәтижелерін оңтайландыру мақсатында олардың өзара байланысын ескере отырып, бір мезгілде таңдау керек. Хроматографиялық процестің аталған параметрлерінің әрқайсысын таңдау жолдарын осында тым қатты баяндау болар еді. Иллюстрация үшін 4 және 5 — тармақтарда-тұз концентрациясын таңдау және осы концентрацияны манипуляциялау тәсілдері.

Жоғарыда көрсетілген, белоктарды колонка бойынша байланыстырудың хроматографиялық аймақтарының жылжуы, атап айтқанда, олардың бастапқы және одан кейінгі гранулалардағы матрицадағы барлық бекітілімдер орындарында десорбциясымен байланысты. Десорбция есебінен түйіршіктер қабатының қозғалмайтын және жылжымалы фазаларында молекулалардың шоғырлануының динамикалық тепе-теңдігі қалпына келтіріледі. Десорбция бастапқыда сор-бирленген ақуыз молекулалары түйіршіктер ішіндегі сұйықтықтағы тұздың концентрациясымен анықталады. Егер ол тым аз болса, онда десорбция іс жүзінде болмайды. Керісінше-матрицаның ашық ионогендік топтары элюенттен «сорады» және ақуыз молекулаларын өзіне бекітеді. Егер элюенттегі тұздың концентрациясы тым үлкен болса, онда ақуыздың барлық молекулалары матрицадан сұйық ортаға десорбцияланады, олардың қозғалмайтын және жылжымалы фазалардағы концентрациясы гель-сүзу кезіндегі сияқты теңестіріледі.

Осыны ескере отырып, келесі алдын ала тәжірибені ақылмен өткіземіз. Таңдалған ион алмасу, таңдалған буфермен теңдестірілген 10 пробиркаға тең үлестермен тең. Алмасудың түйіршіктері, әрине, түбіне түседі. Содан кейін «декантация» сериясымен (яғни отырғызылатын сұйықтықты төгу, оны сол буферге ауыстыру, бірақ тұздың белгілі бір концентрациясы, сілкілеу, Тұндыру және тағы бірнеше рет) түйіршіктер ішіндегі тұздың концентрациясы біртіндеп бірінші түтіктен онға дейін белгілі бір шектерде (оларды әрбір ақуыз үшін таңдап алуға тура келеді) ұлғаюына қол жеткіземіз. Содан кейін барлық пробиркаларға фракциялануға тиісті қоспаның құрамына кіретін ақуыздардың бірінің концентрацияланған су ерітіндісінің бірдей мөлшерін енгіземіз. Пробиркаларды шайқаңыз, тұнбаны тұндырамыз және ультракүлгін сіңіру (немесе ферментативті белсенділік) бойынша он супернатанттардың әрқайсысында ақуыз концентрациясын бағалаймыз.

Біз бірінші пробирканы табамыз, оның супернатантында біздің ақуыз ғана пайда болады. Осылайша, тұздың концентрациясын анықтаймыз, онда динамикалық тепе-теңдік матрицадан ақуыздың ең аз десорбциясы сәйкес келеді. Келесі пробиркаларда тұз концентрациясының ұлғаюына қарай ақуыз көп болады — динамикалық тепе-теңдік анықталған кезде десорбция айтарлықтай болады. Ақырында, супернатанттағы ақуыз концентрациясы барынша жоғары болатын және тұз концентрациясы одан әрі ұлғайған кезде арта түспейтін жағдайға келеміз. Осы пробиркалардың біріншісінде тұздың концентрациясы матрзицадан ақуыздың толық десорбция сәтін көрсетеді. Осы концентрациядан пайызда біздің талдауымыздың аралық нүктелерінде десорбция дәрежесін бағалаймыз және осы ақуыз десорбциясы пайызының динамикалық тепе-теңдік жағдайында тұз концентрациясынан тәуелділігін құраймыз. Болашақ қоспаның барлық басқа ақуыздары үшін бірдей және күріш сияқты қисықтар сериясын аламыз.

Сур.

Қисықтардың осы сериясын қарастыра отырып, буфермен изократтық элюция кезінде өзгермейтін тұз концентрациясы бар, мысалы, Ар нүктесіне сәйкес 1-4 ақуыздарды бөлуге болады деп үміттенуге болады. Ақуыз 1 бірден толығымен десорбциялайды және бірінші кезекте элюент тогымен шығады. Одан кейін 2, 3 және 4 ақуыз сорбция беріктігінің өсу тәртібімен өтеді. Олардың әрқайсысын байланыстыру аймағы алдыңғы белок аймағына қарағанда баған бойынша баяу қозғалатын болады. 5 ақуызы бұл жағдайда препаратты колонкаға бастапқы жағу аймағынан мүлдем шығарылмайды. Оны элюенттегі тұздың концентрациясын Ag мәніне дейін арттыра отырып, бөлек алып тастауға болады. Бұл» екі сатылы » элюция болады.

Егер ақ концентрациясы 3 және 4 ақуыздары нашар бөлінсе, ВР Bg және Bg нүктелерінде тұз концентрациясын таңдай отырып, үш сатылы элюцияны қолдануға болады. Содан кейін алдымен 1 және 2 ақуыздары, содан кейін 3 және 4 ақуыздары жақсы бөлінген.

Әдебиет:

1 Л. В. Курашвили, Л. Н. Бобылева Тығыздығы жоғары липопротеидтер фракциясындағы триглицеридтерді анықтау / зертханалық іс . — N 7. — 1991. — С. 7576.

2 Курашвили Л. В., Владимирова А. а. жүректің ишемиялық ауруымен ауыратындарда ЛЖПВП-дағы триглицеридтердің құрамы //Кардиология. — 7-8. — 1992. — С. 35-38.

3 Курашвили Л. В., Волков А. С. қан донорларында жоғары тығыздықтағы липопротеидтер фракциясындағы холестеринді анықтаудың болжамдық маңыздылығы / / Гематология және трансфузиология. — N 5. — 1993. — С. 39-41.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *