Аффинды хроматография туралы реферат (мәлімет) қазақша.
Белсендірілген матрицалар мен спейсерлер
Аффинды матрицалар үшін қатты негіз болып бізге белгілі 4% немесе 6% сефароз, кейде химиялық бекітілген (CL-сефароза), ал кейбір арнайы жағдайларда (төменде қараңыз) және целлюлоза қызмет етеді.
Матрицаларды химиялық активтендірудің көптеген жолдары бар, сондай-ақ спейсерлердің матрицасынан алшақ. Мұндай белсендіру лиганда (биохимиялық зертхана жағдайында) оларға «қонудың» қарапайымдылығын қамтамасыз ету үшін қажет.
Бұл жерде осы көптеген тәсілдерді қарастыру орынсыз,оның ішінде олардың көпшілігі орта мектеп беретін органикалық химияны аса маңызды білуді талап етеді. (Қызығушылық танытқан және жақсы дайындалған оқырмандарға «ақуыздар мен нуклеин қышқылдарының хроматографиясы» («Наука», 1985) кітабын ұсынамын.
Дегенмен, мәселеге көзқарасты бейнелеу үшін жалпы сипаттарда бір қарапайым және бұрын ұсынылған нұсқаны (алайда, әлі күнге дейін қолданылатын) жазамын.
Онда көптеген бос ОН-топтарын алып жүретін полисахаридті матрицаны активтендіру оны бромцианмен (BrCN) өңдеу жолымен жүргізіледі. Нәтижесінде (қатты сілтілі ортада), реакцияға сәйкес, сефароз жіптерінде қатты отыратын имидокарбонаттың химиялық белсенді топтарын алады. Бұл «охотно» электрофильді топтары лиганда нуклеофильді топтарымен ковалентті байланыс жасайды.
Мысалы, еркін аминогруппасы бар лиганд изомочевина қалдығы арқылы белсендірілген матрицамен хабарласа алады.
Осы реакцияның ағуының тағы екі нұсқасы болуы мүмкін (аммиактың бөлінуімен), бірақ екеуі де сол соңғы нәтижеге әкеледі: лиганд (немесе спейсер соңында аминогруппен) химиялық тұрғыдан матрицамен тығыз байланысады.
Матрицаны активтендірудің сипатталған әдісінің сөзсіз кемшілігі деп бромцианның улылығы және сефарозды активтендіргеннен кейін шаю суларындағы кейбір жанама реакция өнімдерінің (оның ішінде НВг) уыттылығы деп атауға болады.
Спейсерлер ретінде әдетте 1,6 диаминогексан, немесе 6-аминокапрон қышқылы қолданылады. Осылайша, спейсердің бос соңында аминогруппа немесе карбоксил бар. Лиганда оған қосылу арнайы химиялық реакцияны талап етеді.
Сондықтан «Pharmacia» фирмасы дайын матрицаларды шығарады, онда спейсер (6-аминокапрон қышқылы) N-оксисукцинимид соңғы карбоксил этерификациясымен белсендірілген.
Лигандтың аминогруппен қосылуы жұмсақ жағдайда, бір сағат бойы жүреді, бұл лабильдік лигандтар үшін өте маңызды. N-оксисукцинимид ыдырайды және оның орнына сенімді пептидті байланыспен лиганд қосылады.
Лиганды
Ғылыми әдебиетте сипатталған көптеген лигандтарды екі басты санатқа бөлуге болады. Бұл жеке ерекшелігі бар лигандалар және топтық ерекшелігі бар лигандалар, жеке лигандтар ретінде ферменттер, сондай-ақ тиісті ферментативтік реакциялардың субстраттары немесе тежегіштері (ферменттерді тазалау үшін) болуы мүмкін.
Аффинды жұптарды тазарту мақсатында пайдалану фермент-субстрат фермент субстратты түрлендірудің каталитикалық актісін жүзеге асыра алмайтын, тек онымен фермент-субстратты кешенге байланысқан кезде хроматографиялық процестің шарттарын болжайды. (Мысалы, қажетті екінші субстраттың, сәйкес иондардың болмауы немесе рН қолайсыз мәні кезінде).
Екінші жағынан, Биохимияның маңызды бөлімі, әсіресе қолданбалы аспектіде, ферменттер бекітілген алмасуларды құрастыру, бұл жолы оның өнімдері ферменттерден оңай бөлінген жағдайда жетекші катализді құрайды.
Бұл өнімдер колонкадан ағады немесе ферментативтік реакцияны жүргізгеннен кейін супернатантта қалады, одан матрица оған бекітілген ферментпен одан кейін шөгіндіге шығарылады.
Әрине, бұл жағдайларда иммобилизацияланған ферменттің ортасында субстраттың байланыстырылуына ғана емес, сонымен қатар тиісті реакцияның катализіне де жағдай жасалады.
Хроматографиялық матрицада бекітілген ферменттердің айқын артықшылығы, олар реакция өнімдерімен қоспадан автоматты түрде босатылады.
Ферменттер сияқты, ақуыз-рецепторлар гормондарды және басқа да төмен молекулалық әсерлерді байланыстыру және тазалау үшін лигандалар бола алады. Қан плазмасының көлік ақуыздары және ақуыздар — жасушалық мембраналарды тасымалдаушылар-өздерінің төмен молекулалық серіктестерін тазарту үшін.
Лигандтар ретінде қолданылатын матрицалық синтез процестерінің реттеуші ақуыздары мен қатысушылары нуклеин қышқылдарының реттегіш және басқа да ерекше учаскелерін алып тастау бойынша міндеттерді шешуге мүмкіндік береді. Бұл энергия өндіру және тасымалдау жүйелеріне жатады.
Әрине, мұнда аталған биоспецификалық жұптардың барлық қатысушылары рөлдермен ауыстырылуы мүмкін-иммобилизацияланған, аффинды тазарту объектісі бола алады. Белгілі антигендерге ұқсас иммуносорбенттерді құру да өте өнімді болды.
Топтық ерекшелігі бар лигандалар заттардың тұтас тобына ұқсас. Мысалы, «кофермент А» көптеген ферментативті реакцияларға қатысады. Аффиналық матрицада бекітілген, ол тиісті ферменттердің кез келгенін тазалауды қамтамасыз ете алады. Бастапқы препаратта олардың біреуі ғана болған жағдайда, жеке ерекшелігі бар лигандтарды пайдаланғаннан гөрі тазалау нашар болмайды. Кейде іріктелген лигандтардың кейбір тәжірибелі жолмен топтық ерекшелігі олардың қабілетін нақты түсіндіре алмайды.
Мысалы, қышқыл аминополисахарид гепарин (М>10 000) қанның антикоагулянты ретінде белгілі. Сонымен қатар, ол биохимияда рибонуклеаздың бәсекелес ингибиторы ретінде қолдануды тапты. Бұл оның сапасы, шамасы, полимердің РНҚ-мен белгілі бір ұқсастығын көрсетеді.
Сондықтан гепарин нуклеин қышқылдарымен өзара әрекеттесетін бірқатар ақуыздар үшін лиганд ретінде қолданылуы мүмкін: полимераз, растриктаз, кері транскриптаз, ақуыз синтезінің бастамашылық факторлары және басқалар.
Лигандтар ретінде нуклеин қышқылдары да қатыса алады. Белсенді матрицаларда оларды химиялық бекіту тәсілдері бар.
Бірақ ДНҚ мен РНҚ жиірек, олардың жіп құрылымын пайдалана отырып, матрицаларда колентті емес бекітеді: немесе балқытылған күйден оның қатаю процесінде 4%-дық агарозға балқытады, немесе суда құрғақ целлюлоза жіптерінің арасында «шатастырады» — ол кепкен кезде.
Клондау жолымен іріктелген және аффиналық матрицада бекітілген белгілі бір ген бар ДНҚ фрагменттерінде осы генге сәйкес келетін иРНК ұстауға және тазалауға болады.
Зертханалық жағдайларда синтезделген полиуридил қышқылын (поли У) ұзындығы уридиннің жүздеген мономерлерінің brcn-белсендірілген сефарозда ковалентті бекітуге болады.
Содан кейін, жоғары организмдердің шнк көпшілігінде көп немесе аз ұзын полиаденилдік «құйрығы» болуына байланысты, жасушалық лизаттың барлық қалған РНК қоспасынан шнк жиынтық фракциясын бөліп алу керек. Салыстырмалы түрде қысқа тізбектер (10-20 нуклеотидтер) олиго-дезокситимидил қышқылының (олиго дТ) соңғы 5′-фосфат арқылы талшықты целлюлоза матрицасында бекітіледі.
Бұл лигандада алдыңғы жағдайда сияқты, артқы еден арқылы белгілі бір иРНК бекітуге болады. Содан кейін олиго дТ праймер болып табылатын кері транскриптазаның көмегімен, бұл жағдайда матрицамен байланысты болып қалатын және лиганда ретінде әрекет ете алатын ДНҚ-ға екі жақты иРНК синтездеу.
Бұл ретте мүмкін лигандтар тізімін шектейміз, олардың тізімін толық аяқтамай, аффинды хроматографияның қысқаша очерк қорытындысында үш қарапайым мысал қарастырамыз: екі жеке ерекшелігі бар және біреуі — топтық.
Аффинды хроматографияны пайдаланудың кейбір мысалдары
1-мысал. Карбоксипептидаза ферментін егеуқұйрықтың бұлшық етінен тазарту (Bodwell, Meyer, 1981).
«BrCN-активтендірілген сефарозу 4В сажали ақуыз ингибиторы карбоксипептидазы Ал, бөлінген бірі-картоп. Бейтарап буферде 0,4 м КС1 және 2м naci арасында экстрагирленген бұлшықет гомогенатының фракциясын қосымша аммоний сульфатымен тұндыру арқылы тазартып, бейтарап буферде 2м NaCI теңдестірілген ингибиторы бар аффинды колонкаға отырғызады, содан кейін сол ерітіндімен жуады. Ферменттің элюциясы да 2м NaCI, бірақ рН 11,2 кезінде 0,01 М Na2CO3.
Ферменттің ингибитордан үзілуі элюентті қатты шаймалау есебінен болды. Қоспалы ақуыздар жуу кезінде шықты, ал фермент буферді ауыстырғаннан кейін өткір сырмен элюировался
Осы кезеңде тазарту тиімділігін нүктелермен белгіленген екі Пикпен салыстыра отырып бағалауға болады.
Иммундық жүйе
Әрине, біз медициналық иммунологияның кең аумағына терең енуге тырыспаймыз. Талаптарға келсек, тек сол мүмкіндіктерді пайдалану иммунохимического тәсілді ұсынады зерттеу үшін биополимеров.
Алайда, біз немен айналысатынымызды елестету үшін, кем дегенде беттік иммунитет жасау механизмімен, сондай-ақ қанның арнайы жасушаларымен және оны іске асыратын молекулалармен танысу қажет.
Соңғы уақытқа дейін иммунитеттің кең таралған ұғымы, бұл бір рет ең болмаса жеңіл түрде (егу) ауырып қалған ауру қоздырғыштары үшін адамның ұзақ жара бермеуін қамтамасыз ететін жүйе туралы пікірмен шектелді. Бұл да дұрыс.
Бірақ бізде иммундық жүйе болмаса да, бүгінгі таңда ең «Бос» аурулардан өлім-жітім керемет болар еді. Адамзат бұл иммундық жүйеге шабуыл жасайтын ЖИТС вирусына тап болған кезде шын мәнінде түсінді.
Біздің ағзамызға күн сайын миллиондаған ауру тудыратын микробтар мен вирустар кіреді. Олардың барлығын ұйықтамай да, демалыс да иммундық қорғаныс «әскер» қарсы алады. Сондықтан бұл әскер үшін?
Сұрақпен таныс адамдар иммундық жүйе «антиденелерді» өндіреді, олар басып кірген микроорганизмдерді өлтіреді ма, оларды тойтарады ма, залалсыздандырады және өзімен бірге ағзадан шығарады.
Мұның бәрі дұрыс емес. «Непрошенных» келімсектер жояды арнайы ірі жасушалар — фагоциты. Бөтен жасушаны немесе вирусты» танып», олар оларды» жұтады». Сыртқы мембранасы фагоцита құрады тереңдету секілді мешочка, ол обволакивает «чужеземца». Содан кейін қалтаның мойны жуылады, фагоцит қабығы қалпына келтіріледі және» жау » цитоплазмасында көрсетіледі. Бұл жерде ол алдымен қабығын, содан кейін зұлымдық құрбанның жүрегін бұзатын түрлі литикалық ферменттердің шабуылына ұшырайды.
Қанында фагоциттер гранулоциттер деп аталады. Олар ақ қан клеткаларының құрамына кіреді — лейкоциттер» фагоциттер, дене тіндерінде шөгетін макрофагами деп аталады, екі жағдайда да фагоцит бірінші кезекте бөтен адамның «білуге» тиіс. Мұнда барлаушылар мен «нысанашылардың» рөлі антиденелер деп аталатын белокты молекулалардың ерекше түрін орындайды» олар қайдан алынады және «жауды» қалай біледі?
Жалпы айтқанда, оны бірінші кезекте «біледі» (антиденелердің көмегімен) басқа ақ қан жасушалары-лимфоциттер. Бұл өте ұсақ жасушалар. Лимфоциттер инфекциясымен кездескен сәтке дейін бөлінбейді және қан айдары мен жылдарын айналдыра алады. Лимфоциттердің көп шоғырлануы лимфа түйіндерінде, әсіресе бүкіл қан өтетін көкбауырда болады.
Қандағы (оларды жалпы антиген терминімен біріктіреді) және оны «танып» отырып, лимфоциттер өзгеріске ұшырайды. Метаболизм процестері тездетіледі, көлемі артады, ДНҚ синтезі қалпына келтіріледі. Содан кейін бөлу керек. Жіті инфекциялар жағдайында бір лимфоцит жүздеген мың жасушаларды береді және олардың барлығы бірдей антигенді «тану» қабілетін сақтайды. Бұл ұрпақтардың бір бөлігі иммунитет («иммунологиялық жады») қалыптастыра отырып, қанда қалады.
Осы антигеннің белгілерін алған «барлаушылар» саны күрт өседі. Келесі жолы ол қанға түскенде, қалай танылатыны көбейе алмайды. Бірақ одан әрі не? Лимфоциттер фагоциттердің қауіптілігі туралы қалай хабарлайды? Және олар қалай біледі?
Тек антигенмен бастапқы кездесулердің бір бөлігі иммунитет жасау үшін көбеюде. Олардың басқа бөлігі басқа метаморфозға ұшырайды. Цитоплазманың көлемі ұлғаяды, ядро жаққа таралып, ретикулярлы жүйе өседі. Рибосомада ерекше ақуыздардың қарқынды синтезі басталады — біз жоғарыда антиденелер деп атаған «нысанашылардың».
Гольджи аппараты арқылы олар сыртқа шығарылады. Бұл метаморфоздан өткен лимфоциттер енді плазмацит деп аталатын екі мың антиденеге дейін секретіледі. Олардың бір бөлігі қанға түседі, ал бір бөлігі плазмациттер шөгетін лимфа түйіндерінде қалады. Бірінші дозалық лимфоцит ұрпақтарында синтезделген барлық антиденелер трансформацияның барлық тізбегін ынталандыратын сол антигенді тану қабілетін сақтайды.
Ал, бірінші лимфоцит, ол «антигенді» қалай үйренді? ИЯ, жүз мың шамасында оның бетін жабатын бірдей антиденелердің көмегімен. Сонда тұйық шеңбер. Бұл антиденені білетін антиденелер пайда болғанға дейін болған. Оны күтті! Оның және оның ұрпақтарын (егер ол көбейе алатын болса) «білу» үшін олардың беттеріне тойтарыс беру және сол арқылы фагоциттердің шабуылына арналған мақсаттар ретінде белгілеу.
Бірақ денеде әлі пайда болмаған антиген құрылымы туралы бастапқы ақпарат қайдан келді? Ғалымдардың көпшілігі осындай ақпараттың көптеген нұсқаларын, — бастапқы лимфоциттердің көпшілігінде бастапқы тұқым қуалайтын жолмен, жануардың немесе адамның алдыңғы буындарындағы тиісті «танысудың» нәтижесі сияқты болуы мүмкін деп санайды. (Кейбір ғалымдар, керісінше, барлық иммундық жауаптар адам өмірінде басып кірген антигендердің әсерінен қалыптасады деп санайды.
Олар нәрестенің алғашқы айларында иммундық жүйе әлі жұмыс істемейді)
Бірінші нұсқаны бағалауға тырысамыз. Алдымен антиген бетіндегі антиденені не біледі?
Антигендердің пайда болуы мен табиғатының әртүрлілігіне байланысты, ең алдымен, кез келген материалдан: аминқышқылдарының, липидтердің, қанттардың, нуклеотидтердің бірнеше молекулаларынан және тіпті жануар тектес емес Органикалық молекулалардан құрылуы мүмкін қандай да бір кеңістік конфигурациясы болуы мүмкін. Бірақ бұл конфигурация антиденені антигенмен байланыстырудың таңдаулылығына байланысты қиын болуы керек.
Сонымен қатар, молекулалар арасындағы химиялық байланыстардың табиғаты өз шектеулерін қояды. Бұл сан барлық ықтимал табиғи (бактериялар, вирустар, белоктар, нуклеин қышқылдары және т.б.) және жасанды антигендердің шамамен он миллион (~107) шамасына ие. Адам ағзасындағы лимфоциттер саны ~1012.
Бұл дегеніміз, бастапқыда әрбір мүмкін болатын ~105 антигенінің «белгілері» бар «барлаушылар» саны. Бұл лимфоциттердің жалпы санымен салыстырғанда көп емес. Егер » интервент «жалғыз қалса, онда» өзінің барлаушысымен » кездесу мүмкіндігі аз. Бірақ содан кейін оған елеулі зиян болмайды.
Алайда, егер ағзаға бір мезгілде мыңдаған бірдей антигендер кірген болса, онда кездесу ықтималдығы сәйкесінше артады. Әсіресе, егер бұл антигендердің мәні ауру микроорганизмдер, онда тез көбейе бастайды.
Мұнда жағдай түбегейлі өзгереді, көп ұзамай «қайғылы кездесу» сөзсіз болады. Қажетті ерекшеліктің антиденелерін жаппай өңдеу дереу басталады. Олардың көбеюі «келушілердің»көбеюімен бәсекелі күреске түседі.
Егер антиденелер бұл жарысты тез жеңсе, онда бүкіл «басып кіруді әскеріне» белгі қоя алады және оның барлық жауынгерлері аурудың айқын белгілері пайда болғанға дейін екі типтегі фагоциттермен жойылады. Мұндай құбылыстар біздің ағзада күнделікті орын алады. Фагоциттер үшін антиген табиғаты жаман.
Олар оның бетінде кез келген ерекшеліктегі антиденелердің болу фактісін ғана» біледі». (Фагоциттерге қарағанда аса ірі антигендердің басып кірген жағдайда, «жауды» жою үшін басқа да құралдар — комплемент деп аталатын, бірақ сол антиденемен бағытталатын ақуыздар сериясы жұмылдырылады. Біз бұл құралдарды қарастырмаймыз — биохимиялық зерттеу әдістері олар қолданылған жоқ)
Егер бактериялардың немесе вирустардың көбеюі ерекше антиденелердің атқаруынан озса, онда ауру дамиды. Басқа қорғаныс құралдары, мысалы, дене температурасының жоғарылауы, бұл көбеюді тежейді… Ақырында, денені көмекке Жануарлар таба алатын дәрі-дәрмектер немесе дәрілік шөптер тартылады.
Патогенді микроорганизмдер қайтадан басып кірген жағдайда оларды иммунитетпен құрылған ерекше антиденелер мен лимфоциттердің миллиондаған әскері күтіп тұр. Жоғарыда сипатталған «көбейту жарысы» үшін бастапқы жағдай ағзаны қорғаушылардың пайдасына анық көрінеді…
Адамның қанында еркін айналатын және үнемі 1019 антиденелер жаңартылып отырады.1012 лимфоциттер 1017 антиденені көтереді. Демек, 100 есе олардың көп саны қарсыластың «еркін іздеуде». Олардың басым бөлігі-иммунитет тасымалдаушылары.
Мысалы, бөтен ақуыз (бұл әрекет қоянның иммунизациясы деп аталады), оның ағзасында белгілі бір уақыт ішінде тек осы ақуызды «тануға» қабілетті ерекше антиденелер көп мөлшерде өндіріледі.